قياس استهلاك الأوكسجين المتقدرية الكبد وحركية تسرب بروتون لتقدير التنفس المتقدرية في الأبقار الحلوب هولشتاين
Summary
ونشاطر هنا، أساليب لقياس استهلاك الأوكسجين المتقدرية، تعريف مفهوم علم الطاقة الغذائية، وتسرب بروتون، السبب الرئيسي لعدم الكفاءة في جيل الميتوكوندريا من ATP. هذه النتائج يمكن أن تمثل 30 في المائة الطاقة المفقودة في استخدام المواد الغذائية للمساعدة في تقييم الوظيفة المتقدرية.
Abstract
استهلاك الأوكسجين، دافع بروتون القوة (تحلان) وتسرب بروتون قياسات التنفس المتقدرية، أو مدى الميتوكوندريا قادرة على تحويل ATP NADH والقوات المسلحة الهايتية. منذ الميتوكوندريا هي أيضا الموقع الأساسي لاستخدام الأوكسجين والمغذيات الأكسدة إلى ثاني أكسيد الكربون والماء، مدى فعالية استخدام الأوكسجين، وإنتاج ATP مباشرة تتصل بكفاءة الأيض المغذيات، المتطلبات الغذائية من الحيوان، و صحة الحيوان. والغرض من هذا الأسلوب هو فحص التنفس المتقدرية، التي يمكن استخدامها لدراسة آثار المخدرات المختلفة، والوجبات الغذائية والآثار البيئية على الأيض المتقدرية. وتشمل النتائج استهلاك الأوكسجين قياس التنفس يتوقف بروتون (3 الدولة) وبروتون تسرب تعتمد التنفس (4 الدولة). يعرف بأنه نسبة التحكم الجهاز التنفسي (آر) نسبة التنفس الدولة 4 (3) الدولة ويمكن أن تمثل كفاءة حيوية المتقدرية. تسرب بروتون المتقدرية هي عملية تسمح تبديد للغشاء الميتوكوندريا المحتملة (MMP) يفصل الفسفرة من ADP تناقص كفاءة توليف ATP. تستخدم أقطاب حساس الأكسجين وترمب + مع ركائز mitochondrial ومثبطات سلسلة نقل الإلكترون لقياس الدولة 3 و 4 حالة التنفس، غشاء الميتوكوندريا تحلان (أو يمكن أن تنتج ATP) وتسرب بروتون. القيود على هذا الأسلوب هي أن نسيج الكبد يجب أن تكون طازجة قدر الإمكان ويجب تنفيذ جميع خزعات وفحوصات في أقل من 10 ح. وهذا يحصر عدد العينات التي يمكن جمعها ومعالجتها بواسطة شخص واحد في يوم واحد لحوالي 5. ومع ذلك، مطلوب 1 جرام فقط من أنسجة الكبد، حتى في الحيوانات الكبيرة، مثل الأبقار الحلوب، كمية العينة المطلوبة صغيرة بالنسبة لحجم الكبد، وهناك القليل من الوقت الانتعاش اللازم.
Introduction
الميتوكوندريا حساسة للغاية للتأكيد وبيئتها الخلوية يمكن أن تسهم في مجموعة متنوعة واسعة من الأمراض الأيضية. استهلاك الأوكسجين وتسرب بروتون في الميتوكوندريا مؤشرات الصحة الميتوكوندريا. الطرق الموضحة في هذه الورقة كفاءة الطاقة المتقدرية تقدير استخدام آر استناداً إلى استهلاك الأوكسجين مع أو بدون تسرب بروتون. هذه النتائج يمكن أن تمثل 30 في المائة الطاقة المفقودة في استخدام المغذيات1. يمكن تحديد التغييرات في الاستهلاك وبروتون تسرب الأوكسجين خلل mitochondrial الذي يساهم في الأمراض الأيضية وتؤدي إلى انخفاض الطاقة الكفاءة. يمكن أيضا استخدام هذه الأساليب دراسة تأثير العلاجات المختلفة في التنفس المتقدرية. والهدف العام لقياس استهلاك الأوكسجين mitochondrial وحركية تسرب بروتون تقييم الوظيفة المتقدرية وكفاءة حيوية.
خلل المتقدرية الكبدية ارتبطت بالعديد من الأمراض في الأبقار الحلوب. تتأثر قدرة الأيض الخلوية للتبديل بين أنواع الوقود الكربوهيدرات والدهون عندما تواجه بعجز الطاقة في الرضاعة المبكرة بعدد ووظيفة الميتوكوندريا في الخلية2. العيوب الموجودة في الميتوكوندريا قادرة على التكيف مع زيادة طلب على الطاقة وزيادة بيتا–الأكسدة يمكن أن يؤدي إلى تراكم الدهون داخل الخلايا المرتبطة بمقاومة الأنسولين ويمكن أن يؤدي إلى تشكيل الكبد الدهني في الأبقار الحلوب الرضاعة المبكرة. الميتوكوندريا، كموقع هيئة كيتون الإنتاج والاستخدام، يمكن أن تلعب دوراً رئيسيا في الكيتوزيه في الأبقار الحلوب3. الافتقار إلى الميتوكوندريا أو خلل mitochondrial سوف تؤثر على توافر الوقود إلى الهامش، وتنعكس في التغيرات في استهلاك الأكسجين أو آر.
التغييرات استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا استجابة لالتهاب. دجاجة عمره سبعة أيام تم عشوائياً إلى مجموعة المصابين مع ماكسيما ايميريا و مجموعة تحكم4. الفراريج التي لم تطرأ التحدي الكوكسيديا قد خفض استهلاك الأكسجين بسبب تسرب بروتون وار أعلى مما يشير إلى أن الميتوكوندريا الكبد الاستجابة لتحدي منأى بزيادة بروتون تسرب. حين تسرب بروتون ورد الفعل إنتاج الأنواع الأوكسجين كان يعتبر علامة على الخلل في غشاء الميتوكوندريا وتضر بكفاءة حيوية، الآن ومن المعروف أن من المهم للبروتينات والكالسيوم استيراد الميتوكوندريا5 ، ومن أجل توليد الحرارة1.
تسرب إلكترون من سلسلة التنفس يجعل الميتوكوندريا عرضه لإنتاج الأنواع الأكسجين التفاعلية والضرر التأكسدي للغشاء الميتوكوندريا والبروتينات، والدهون والحمض النووي. كما سن الميتوكوندريا، يمكن أن تتراكم الأضرار خاصة إلى متدنا تسبب مزيدا من الخلل في التمثيل الغذائي المتقدرية6 وقابلية أكبر للبقرة للمرض. في الممارسة العملية، ويتم تغذية العديد من المواشي الحيوانات مستويات عالية من المكملات الغذائية مثل النحاس والزنك ومينيسوتا لتعزيز وظيفة المضادة للأكسدة. ومع ذلك، تغذية مستويات عالية من النحاس، الزنك والمنغنيز انخفاض إنتاج الحليب وزيادة استهلاك الأكسجين بسبب بروتون تسرب (4 حالة التنفس)7.
البحوث السابقة بشأن دور الوظيفة المتقدرية في كفاءة استخدام الطاقة في الماشية تركز على التغيرات في استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا وتسرب بروتون. وقد نشرت دراسات قليلة جداً في الأبقار الحلوب وأوراق معظم مقارنة كفاءة الإنتاج في شكل كمية الأعلاف المتبقية (آر إف أي) للوظيفة المتقدرية في الأبقار. تقلب في التنفس المتقدرية بحثت معدلات قياس الدولة 3، 4 وار في كبد من بقرة هولشتاين الحوامل والمرضعات من لحوم البقر الأبقار (انجوس، برانجوس وهيريفورد)8. الباحثون لم تجد أي علاقة في التنفس المتقدرية مع النمو أو الصفات للأبقار الحلوب ولكنها قدمت تقريرا علاقة بين التنفس المتقدرية وحلب الصفات الهولشتاين. في دراستين، تمت مقارنة RFI في الأبقار إلى معدلات التنفس المتقدرية (الدولة 3، الدولة 4 وار) في العضلات الميتوكوندريا9،10. تغيير معدلات التنفس المتقدرية ردا على DMI وانخفاض معدلات كانت ترتبط بأقل كفاءة من يرسم لحوم البقر. وفي دراسة أخرى، قورنت RFI ليرسم من الثيران آر إف أي ارتفاع أو انخفاض معدلات التنفس المتقدرية وبروتون تسرب حركية بين هاتين المجموعتين من ذرية11. وتعزى الاختلافات مكسب يؤكد الاستنتاج بأن اكتساب عدم تأثير التنفس المتقدرية في الأبقار.
في هذه الورقة، وتجربة دراسة الكبد سي ردا على تغذية 3 المضادة للأكسدة المعادن المرضعات ماشية الألبان يوضح استخدام أساليب لقياس استهلاك الأوكسجين أثناء الدولة 4 و 3 التنفس وتحلان.
Protocol
Representative Results
Discussion
معظم النقطة الحرجة في البروتوكول هو الحصول على عينة تمثيلية من أنسجة كبد وبداية عزلة الميتوكوندريا، في أقرب وقت ممكن بعد خزعة. التباين في قياسات التنفس المنخفض (الجدول 1) بسبب وقت نقل قصيرة من البقرة إلى مختبر. لتقليل وقت النقل، أنشئ مختبر صغير في المكتب لمنتجات الألبان، وطردوا كب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث الأموال اللتيتش وتظليل وزارة الزراعة من خلال المركز “الصحة الحيوانية الأغذية” في جامعة كاليفورنيا ديفيس مدرسة الطب البيطري.
Materials
| Liver Biopsy | |||
| Equipment | |||
| Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument | Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
| Suture | Fisher Scientific | 19-037-516 | |
| Suture needles | NA | NA | Included with Suture |
| Scalpels | Sigma – Aldrich | S2896 / S2646 | # for handle and blades |
| Surgery towels | Fisher Scientific | 50-129-6667 | |
| Falcon tubes 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Tweezers | Sigma – Aldrich | Z168750 | |
| 50 mL syringes | Fisher Scientific | 22-314387 | |
| Injection needles (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
| Cow halter | Tractor Supply Co. | 101966599 | |
| Cotton swabbing | Fisher Scientific | 14-959-102 | |
| cotton gauze squares (4×4) | Fisher Scientific | 22-246069 | |
| Medical scissors | Sigma – Aldrich | Z265969 | |
| Chemicals | |||
| Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow | Provided by Veterinarian | ||
| Clostridia Vaccine | Provided by Veterinarian | ||
| Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days | Provided by Veterinarian | ||
| Providone Scrub | Aspen Veteterinary Resources | 21260221 | |
| Ethanol 70% | Sigma – Aldrich | 793213 | |
| Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight | Provided by Veterinarian | ||
| 2% lidocaine HCl (10-15 mL) | Provided by Veterinarian | ||
| 1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine | Provided by Veterinarian | ||
| Isolation of Mitochondria (liver) | |||
| Equipment | |||
| Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance | Fisher Scientific | 02-911-527 | |
| Homogenizer Motor | Cole Parmer | EW-04369-10 | |
| Homogenizer Probe | Cole Parmer | EW-04468-22 | |
| Auto Pipette (10 mL) | Cole Parmer | SK-21600-74 | |
| Beaker (500 mL) with ice | Fisher Scientific | FB100600 | |
| Refrigerated microfuge | Fisher Scientific | 75-002-441EW3 | |
| Microfuge tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | AM12400 | |
| Chemicals | |||
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) | abcam | ab102536 | |
| Sucrose | Sigma – Aldrich | S7903-1KG | |
| Tris-HCl | Sigma – Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma – Aldrich | EDS-1KG | |
| BSA (fatty acid free) | Sigma – Aldrich | A7030-50G | |
| Mannitol | Sigma – Aldrich | M4125-1KG | |
| Deionized water | Sigma – Aldrich | 38796 | |
| Hepes | Sigma – Aldrich | H3375-500G | |
| Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA, pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator | |||
| Mitochondrial Oxygen Comsuption | |||
| Equipment | |||
| Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode | Hansatech (PP Systems) | OXY1 | |
| Thermoregulated Water Pump | ADInstruments | MLE2001 | |
| Clark type Oxygen electrode | NA | NA | |
| Autopipette (1 mL) | Cole Parmer | SK-21600-70 | Included with Oxy1 |
| Small magnetic stir bar | Fisher Scientific | 14-513-95 | |
| Micropipette (10 μL) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
| pH meter | VWR | ||
| Chemicals | |||
| KCl | Sigma – Aldrich | P9333-1KG | |
| Hepes | Sigma – Aldrich | H3375-500G | |
| KH2PO4 | Sigma – Aldrich | P5655-1KG | |
| MgCl2 | Sigma – Aldrich | M1028-100ML | |
| EGTA | Sigma – Aldrich | E3889-100G | |
| Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
| Rotenone (4 mM solution) | Sigma – Aldrich | R8875-5G | |
| Succinate (1 M solution) | Sigma – Aldrich | S3674-250G | |
| ADP (100 mM solution) | Sigma – Aldrich | A5285-1G | |
| Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) | Sigma – Aldrich | 75351 | |
| FCCP | Sigma – Aldrich | C2920 | |
| Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force | |||
| Equipment | |||
| TPMP electrode | World Precision Instruments. | DRIREF-2 | |
| Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs | |||
| Malonate (0.1 mM solution) | Sigma – Aldrich | M1296 | |
| Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma – Aldrich | 75351 | |
| Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma – Aldrich | N7143 | |
| FCCP | Sigma – Aldrich | C3920 | |
| TPMP | Sigma – Aldrich | T200 | |
| TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
References
- Brand, M. D., Divakaruni, A. S. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26, 192-205 (2011).
- Stephenson, E. J., Hawley, J. A. Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war. Biochimica et Biophysica Acta. 1840, 1285-1294 (2014).
- Bartlett, K., Eaton, S. Mitochondrial B oxidation. European Journal of Biochemistry. 271, 462-469 (2004).
- Acetoze, G., Kurzbard, R., Klasing, K. C., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Oxygen Consumption, Respiratory Control Ratio (RCR) and Mitochondrial Proton Leak of broilers with and without growth enhancing levels of minerals supplementation challenged with Eimeria maxima (Ei). Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 101, e210-e215 (2016).
- Wallace, D. C., Fan, W. Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics. Mitochondrion. 10, 12-31 (2010).
- Paradies, G., Petrosillo, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M. Oxidative stress, mitochondrial bioenergetics and cardiolipin in aging. Free Radicals in Biology and Medicine. 48, 1286-1295 (2010).
- Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Liver mitochondrial oxygen consumption and efficiency of milk production in lactating Holstein cows supplemented with Copper, Manganese and Zinc. Journal of Animal Physiology Animal Nutrition. 102, e787-e797 (2017).
- Brown, D. R., DeNise, S. K., McDaniel, R. G. Mitochondrial respiratory metabolism and performance of cattle. Journal of Animal Science. 66, 1347-1354 (1988).
- Golden, M. S., Keisler, J. W., H, D. The relationship between mitochondrial function and residual feed intake in Angus steers. Journal of Animal Science. 84, 861-865 (2006).
- Lancaster, P. A., Carstens, G. E., Michal, J. J., Brennan, K. M., Johnson, K. A., Davis, M. E. Relationships between residual feed intake and hepatic mitochondrial function in growing beef cattle. Journal of Animal Science. 92, 3134-3141 (2014).
- Acetoze, G., Weber, K. L., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Relationship between liver mitochondrial respiration and proton leak kinetics in low and high RFI steers from two lineages of RFI Angus bulls. ISRN Vet Sci. 2015 (194014), (2015).
- Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Protection against oxidants in biological systems: The superoxide theory of oxygen toxicity. Free Radicals in Biology and Medicine. , 186-187 (1989).
- National Research Council. . Nutrient Requirements of Dairy Cattle. , (2001).
- Ramsey, J. J., Harper, M. E., Weindruch, R. Restriction of energy intake, energy expenditure, and aging. Free Radical Biology and Medicine. 29, 946-968 (2000).
- Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity: beyond ATP. Nature. 17, 608-620 (2017).
- Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. Biochemical assays of respiratory chain complex activity. Methods in Cell Biology. 80, 93-119 (2007).
- Alex, A. P., Collier, J. L., Hadsell, D. L., Collier, R. J. Milk yield differences between 1x and 4x milking are associated with changes in mammary mitochondrial number and milk protein gene expression, but not mammary cell apoptosis or SOCS gene expression. Journal of Dairy Science. 98, 4439-4448 (2015).
- Lossa, S., Lionetti, L., Mollica, M. P., Crescenzo, R., Botta, M., Barletta, A., Liverini, G. Effect of high-fat feeding on metabolic efficiency and mitochondrial oxidative capacity in adult rats. British Journal of Nutrition. 90, 953-960 (2003).
- Boily, G., Seifert, E. L., Bevilacqua, L., He, X. H., Sabourin, G., Estey, C., Moffat, C., Crawford, S., Saliba, S., Jardine, K., Xuan, J., Evans, M., Harper, M. E., McBurney, M. W. SirT1 regulates energy metabolism and response to caloric restriction in mice. PloS One. 3 (3), e1759 (2008).
- Chen, Y., Hagopian, K., Bibus, D., Villaba, J. M., Lopez-Lluch, G., Navas, P., Kim, K., McDonald, R. B., Ramsey, J. J. The influence of dietary lipid composition on liver mitochondria from mice following 1 month of calorie restriction. Bioscience Reports. 33, 83-95 (2013).
- Chacko, B. K., Kramer, P. A., Ravi, S., Benavides, G. A., Mitchell, T., Dranka, B. P., Ferrick, D., Singal, A. K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research. Clinical Science. 127, 367-373 (2014).
