Summary

מדידת צריכת החמצן מיטוכונדריאלי הכבד ואת פרוטון הדליפה קינטיקה להעריך נשימה מיטוכונדריאלי ב בקר לחלב הולשטיין

Published: November 30, 2018
doi:

Summary

כאן, אנו חולקים שיטות למדידת צריכת החמצן מיטוכונדריאלי, הגדרת המושג של energetics תזונתי, פרוטון הנזילה, הגורם העיקרי של חוסר היעילות בדור מיטוכונדריאלי של ATP. תוצאות אלו יכול להסביר 30% מהאנרגיה שקוע ניצול מזין כדי לעזור להעריך תפקוד מיטוכונדריאלי.

Abstract

צריכת החמצן, פרוטון מניע כוח (PMF) ויש דליפת פרוטון המידות של נשימה מיטוכונדריאלי, או כמה טוב המיטוכונדריה הם מסוגלים להמיר NADH ו FADH ATP. מאז המיטוכונדריה הם גם האתר הראשי עבור השימוש החמצן וחמצון מזין פחמן דו-חמצני ומים, איך ביעילות הם להשתמש בחמצן, מייצרים ATP ישירות מתייחס יעילות חילוף החומרים התזונתיים, דרישות התזונתי של החיה, ו בריאות של החיה. מטרת שיטה זו היא לבחון את הנשימה מיטוכונדריאלי, אשר יכול לשמש כדי לבחון את ההשפעה של תרופות שונות, דיאטות and השפעות סביבתיות על חילוף החומרים מיטוכונדריאלי. התוצאות כוללות צריכת החמצן הנמדדת נשימה התלויים פרוטון (המדינה 3) ומערכת פרוטון הדליפה התלויים נשימה (4 המדינה). היחס של המדינה 4 3 / המדינה נשימה מוגדר יחס בקרת הנשימה (RCR) ולייצג מיטוכונדריאלי יעילות אנרגטית. פרוטון מיטוכונדריאלי הדליפה היא תהליך המאפשר פיזור של פוטנציאל הממברנה מיטוכונדריאלי (MMP) על ידי זרחון חמצוני uncoupling מ- ADP להפחתת היעילות של סינתזת ATP. חמצן ו- TRMP + אלקטרודות רגיש עם מצעים מיטוכונדריאלי, מעכבי שרשרת האלקטרונים תחבורה משמשות למדידת מצב 3 ו- 4 מצב נשימה, ממברנה מיטוכונדריאלי PMF (או פוטנציאל לייצר ATP), דליפת פרוטון. מגבלות לשיטה זו הם כי רקמת הכבד חייבים להיות טריים ככל האפשר, ביופסיות וכל מבחני חייב להתבצע תוך פחות מ 10 h. זה מגביל את מספר דוגמאות אשר ניתן לאסוף ולהשתמש שעובדו על-ידי אדם אחד ביום אחד כדי כ 5. עם זאת, רק 1 גרם של רקמת הכבד נדרש, כך בבעלי חיים גדולים, כגון בקר לחלב, כמות הדגימה הצורך הוא קטן יחסית לגודל כבד, יש מעט זמן ההחלמה הדרוש.

Introduction

המיטוכונדריה הם מאוד רגיש ללחץ, הסביבה התאית שלהם יכול לתרום למגוון רחב של מחלות מטבוליות. צריכת החמצן פרוטון דליפת בתוך המיטוכונדריה אינדיקטורים של המיטוכונדריה בריאות בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. בשיטות המתוארות הזה יעילות אנרגיה מיטוכונדריאלי הערכה של נייר באמצעות RCR מבוסס על צריכת חמצן עם וללא דליפה פרוטון. תוצאות אלו יכול להסביר 30% מהאנרגיה איבד ניצול מזין1. שינויים דליפת חמצן צריכת ואת פרוטון יכול לזהות בתפקוד מיטוכונדריאלי אשר תורם למחלות מטבוליות ותוצאות יעילות אנרגיה ירד. שיטות אלה יכולים לשמש גם כדי לבחון את ההשפעה של טיפולים שונים על נשימה מיטוכונדריאלי. המטרה הכוללת של מדידת צריכת החמצן מיטוכונדריאלי וקינטיקה הדליפה פרוטון הוא להעריך תפקוד מיטוכונדריאלי ויעילות אנרגטית.

בעיות בתפקוד הכבד מיטוכונדריאלי כבר קשור למחלות רבות בבקר לחלב. היכולת של חילוף החומרים הסלולר כדי לעבור בין הפחמימות, השומנים דלקים להתמודדות עם גירעון האנרגיה הנקה מוקדם מושפעת את המספר והתפקוד של המיטוכונדריה בתא2. ליקויים ביכולת של המיטוכונדריה להסתגל הביקוש אנרגיה וβ-חמצון מוגבר יכול להוביל להצטברות של השומנים תאיים הקשורים עם תנגודת לאינסולין, עלול להוביל להיווצרות של כבד שומני בפרות חלב הנקה מוקדם. המיטוכונדריה, כמו האתר של הגוף קטון בייצור ושימוש, יכול לשחק תפקיד מפתח ketosis פרות חלב3. חוסר המיטוכונדריה או בתפקוד מיטוכונדריאלי תשפיע על דלק זמינות לפריפריה, יבואו לידי ביטוי שינויים צריכת חמצן או RCR.

שינויים בצריכת החמצן מיטוכונדריאלי בתגובה לדלקת. בת שבע יום פטם חולקו באופן אקראי לקבוצת נגוע Eimeria maxima ו שליטה קבוצה4. פטם זה לא עברה כגון האתגר היה צריכת חמצן נמוכה בשל דליפת פרוטון RCR גבוה המציין כי המיטוכונדריה הכבד להגיב לאתגר המערכת החיסונית על ידי הגדלת הדליפה פרוטון. בעת דליפת פרוטון ומגיבים הפקת מינים חמצן פעם אחת נחשב סימן של חוסר תפקוד ממברנה מיטוכונדריאלי, פוגעת יעילות אנרגטית, עכשיו זה ידוע שזה חשוב עבור ייבוא של חלבונים וסידן לתוך המיטוכונדריה5 , ובשביל הדור של חום1.

דליפת אלקטרונים בשרשרת הנשימה הופכת המיטוכונדריה רגישים ייצור מינים חמצן תגובתי, נזק חמצוני מיטוכונדריאלי קרום חלבונים, שומנים, דנ א מיטוכונדריאלי. כמו גיל המיטוכונדריה, נזק יכול להצטבר במיוחד כדי mtDNA גורם נוסף תפקוד חילוף החומרים מיטוכונדריאלי6 ו ולרגישות רבה יותר של הפרה למחלות. בפועל, חיות משק רבות אכלו רמות גבוהות של תוספי מזון כגון Cu, Zn, Mn כדי להגביר את הפונקציה נוגד חמצון. אולם, האכלה רמות גבוהות של Cu, Zn, Mn ירד ייצור החלב, גדלה צריכת חמצן בשל פרוטון דליפה (4 מצב הנשימה)7.

מחקרים קודמים על התפקיד של הפונקציה מיטוכונדריאלי ביעילות אנרגיה בבקר התמקדה שינויים צריכת החמצן מיטוכונדריאלי פרוטון הדליפה. אך מעט מחקרים פורסמו ב בקר לחלב והשווה רוב המסמכים יעילות הייצור בצורה של צריכת המזון שיורית (RFI) לפונקציה מיטוכונדריאלי ב בקר. השתנות בנשימה מיטוכונדריאלי המחירים נבחנו על ידי מדידת מצב 3, 4 והמדינה RCR ב הכבדים של פרות הולשטיין מניקות והן מניקות בשר פרות (אנגוס, Brangus והרפורד)8. החוקרים לא מצאו קשר בנשימה מיטוכונדריאלי עם צמיחה או חליבה תכונות עבור בקר אבל דיווחת מתאם בין נשימה מיטוכונדריאלי חליבה תכונות עבור Holsteins. שני מחקרים, RFI נמשל ב בקר תעריפי נשימה מיטוכונדריאלי (המדינה 3, 4 והמדינה RCR) שרירים המיטוכונדריה9,10. נשימה מיטוכונדריאלי המחירים השתנו בתגובה DMI, המחירים הנמוכים היו קשורים עם שוורים בשר פחות יעילה. במחקר אחר, RFI של שוורים מתוך שוורים RFI גבוה או נמוך הושוו עם שיעורי נשימה מיטוכונדריאלי וקינטיקה הדליפה פרוטון בין שתי הקבוצות של רומא11. ההבדלים היו בגלל רווח המאשרת למסקנה לזכות אינה לא ההשפעה נשימה מיטוכונדריאלי ב בקר.

בנייר זה, ניסוי בחינת הכבד RCR בתגובה 3 חמצון מינרלים להאכלת בקר לחלב מניקות מדגימה השימוש בשיטות למדידת צריכת החמצן במהלך המדינה 4 ואת המדינה 3 נשימה ומערכת PMF.

Protocol

כל השיטות, פרוטוקול ולימודי המתוארים כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת קליפורניה, דייוויס. 1. לקבל את ביופסיה של הכבד של פרה חלב הולשטיין הערה: ביופסיה של הכבד צריכה להתבצע על-ידי וטרינר מורשה. ביופסיות כבד יכול להתבצע ?…

Representative Results

תוצאות חיוביות מציג קינטיקה הדליפה RCR ופרוטון מוצגים בטבלה 1 ו- 15 איור, בהתאמה. ב מחקר7, RCR ו חלבון הדליפה קינטיקה נמדדו ב פרות הולשטיין-70 יום בחלב אחרי הפרות היו הואכלו 1 של 5 רמות שונות של Zn, Cu, Mn במשך 28 ימים. המדינה 4, נשימה מקסימלית הפרוט?…

Discussion

הנקודה שבה רוב בפרוטוקול קבלת מדגם מייצג רקמת הכבד, מתחיל את ניתוקה של המיטוכונדריה בהקדם האפשרי לאחר ביופסיה. וריאציה במדידות נשימה הוא נמוך (טבלה 1) בשל תקופה קצרה בתחבורה ציבורית פרה למעבדה. כדי לצמצם את זמן תחבורה, מעבדה קטנה הוקם במשרד של החלב, דגימות הכבד גורשו למעבדה office כפי …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי קרנות Alltech פתח משרד החקלאות דרך המרכז לבריאות בעלי חיים מזון ב- UC דיוויס בית הספר לרפואה וטרינרית.

Materials

Liver Biopsy
Equipment
Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument Sontec Instruments Englewood CO 1103-904
Suture Fisher Scientific 19-037-516
Suture needles NA NA Included with Suture
Scalpels Sigma – Aldrich S2896 / S2646 # for handle and blades
Surgery towels Fisher Scientific 50-129-6667
Falcon tubes 50 mL Fisher Scientific 14-432-22
Tweezers Sigma – Aldrich Z168750
50 mL syringes Fisher Scientific 22-314387
Injection needles (22, 2 1/2) VWR MJ8881-200342
Cow halter Tractor Supply Co. 101966599
Cotton swabbing Fisher Scientific 14-959-102
cotton gauze squares (4×4) Fisher Scientific 22-246069
Medical scissors Sigma – Aldrich Z265969
Chemicals
Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow Provided by Veterinarian
Clostridia Vaccine Provided by Veterinarian
Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days Provided by Veterinarian
Providone Scrub Aspen Veteterinary Resources 21260221
Ethanol 70% Sigma – Aldrich 793213
Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight Provided by Veterinarian
2% lidocaine HCl (10-15 mL) Provided by Veterinarian
1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine Provided by Veterinarian
Isolation of Mitochondria (liver)
Equipment
Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance Fisher Scientific 02-911-527
Homogenizer Motor Cole Parmer EW-04369-10
Homogenizer Probe Cole Parmer EW-04468-22
Auto Pipette (10 mL) Cole Parmer SK-21600-74
Beaker (500 mL) with ice Fisher Scientific FB100600
Refrigerated microfuge Fisher Scientific 75-002-441EW3
Microfuge tubes (1.5 mL) Fisher Scientific AM12400
Chemicals
Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) abcam ab102536
Sucrose Sigma – Aldrich S7903-1KG
Tris-HCl Sigma – Aldrich T1503-1KG
EDTA Sigma – Aldrich EDS-1KG
BSA (fatty acid free) Sigma – Aldrich A7030-50G
Mannitol Sigma – Aldrich M4125-1KG
Deionized water Sigma – Aldrich 38796
Hepes Sigma – Aldrich H3375-500G
Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA,  pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator
Mitochondrial Oxygen Comsuption
Equipment
Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode Hansatech (PP Systems) OXY1
Thermoregulated Water Pump ADInstruments MLE2001
Clark type Oxygen electrode NA NA
Autopipette (1 mL) Cole Parmer SK-21600-70 Included with Oxy1
Small magnetic stir bar Fisher Scientific 14-513-95
Micropipette (10 μL) Cole Parmer SK-21600-60
pH meter VWR
Chemicals
KCl Sigma – Aldrich P9333-1KG
Hepes Sigma – Aldrich H3375-500G
KH2PO4 Sigma – Aldrich P5655-1KG
MgCl2 Sigma – Aldrich M1028-100ML
EGTA Sigma – Aldrich E3889-100G
Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA
Rotenone (4 mM solution) Sigma – Aldrich R8875-5G
Succinate (1 M solution) Sigma – Aldrich S3674-250G
ADP (100 mM solution) Sigma – Aldrich A5285-1G
Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) Sigma – Aldrich 75351
FCCP Sigma – Aldrich C2920
Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force
Equipment
TPMP electrode World Precision Instruments. DRIREF-2
Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs
Malonate (0.1 mM solution) Sigma – Aldrich M1296
Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer Sigma – Aldrich 75351
Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer Sigma – Aldrich N7143
FCCP Sigma – Aldrich C3920
TPMP Sigma – Aldrich T200
TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA

References

  1. Brand, M. D., Divakaruni, A. S. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26, 192-205 (2011).
  2. Stephenson, E. J., Hawley, J. A. Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war. Biochimica et Biophysica Acta. 1840, 1285-1294 (2014).
  3. Bartlett, K., Eaton, S. Mitochondrial B oxidation. European Journal of Biochemistry. 271, 462-469 (2004).
  4. Acetoze, G., Kurzbard, R., Klasing, K. C., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Oxygen Consumption, Respiratory Control Ratio (RCR) and Mitochondrial Proton Leak of broilers with and without growth enhancing levels of minerals supplementation challenged with Eimeria maxima (Ei). Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 101, e210-e215 (2016).
  5. Wallace, D. C., Fan, W. Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics. Mitochondrion. 10, 12-31 (2010).
  6. Paradies, G., Petrosillo, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M. Oxidative stress, mitochondrial bioenergetics and cardiolipin in aging. Free Radicals in Biology and Medicine. 48, 1286-1295 (2010).
  7. Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Liver mitochondrial oxygen consumption and efficiency of milk production in lactating Holstein cows supplemented with Copper, Manganese and Zinc. Journal of Animal Physiology Animal Nutrition. 102, e787-e797 (2017).
  8. Brown, D. R., DeNise, S. K., McDaniel, R. G. Mitochondrial respiratory metabolism and performance of cattle. Journal of Animal Science. 66, 1347-1354 (1988).
  9. Golden, M. S., Keisler, J. W., H, D. The relationship between mitochondrial function and residual feed intake in Angus steers. Journal of Animal Science. 84, 861-865 (2006).
  10. Lancaster, P. A., Carstens, G. E., Michal, J. J., Brennan, K. M., Johnson, K. A., Davis, M. E. Relationships between residual feed intake and hepatic mitochondrial function in growing beef cattle. Journal of Animal Science. 92, 3134-3141 (2014).
  11. Acetoze, G., Weber, K. L., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Relationship between liver mitochondrial respiration and proton leak kinetics in low and high RFI steers from two lineages of RFI Angus bulls. ISRN Vet Sci. 2015 (194014), (2015).
  12. Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Protection against oxidants in biological systems: The superoxide theory of oxygen toxicity. Free Radicals in Biology and Medicine. , 186-187 (1989).
  13. National Research Council. . Nutrient Requirements of Dairy Cattle. , (2001).
  14. Ramsey, J. J., Harper, M. E., Weindruch, R. Restriction of energy intake, energy expenditure, and aging. Free Radical Biology and Medicine. 29, 946-968 (2000).
  15. Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity: beyond ATP. Nature. 17, 608-620 (2017).
  16. Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. Biochemical assays of respiratory chain complex activity. Methods in Cell Biology. 80, 93-119 (2007).
  17. Alex, A. P., Collier, J. L., Hadsell, D. L., Collier, R. J. Milk yield differences between 1x and 4x milking are associated with changes in mammary mitochondrial number and milk protein gene expression, but not mammary cell apoptosis or SOCS gene expression. Journal of Dairy Science. 98, 4439-4448 (2015).
  18. Lossa, S., Lionetti, L., Mollica, M. P., Crescenzo, R., Botta, M., Barletta, A., Liverini, G. Effect of high-fat feeding on metabolic efficiency and mitochondrial oxidative capacity in adult rats. British Journal of Nutrition. 90, 953-960 (2003).
  19. Boily, G., Seifert, E. L., Bevilacqua, L., He, X. H., Sabourin, G., Estey, C., Moffat, C., Crawford, S., Saliba, S., Jardine, K., Xuan, J., Evans, M., Harper, M. E., McBurney, M. W. SirT1 regulates energy metabolism and response to caloric restriction in mice. PloS One. 3 (3), e1759 (2008).
  20. Chen, Y., Hagopian, K., Bibus, D., Villaba, J. M., Lopez-Lluch, G., Navas, P., Kim, K., McDonald, R. B., Ramsey, J. J. The influence of dietary lipid composition on liver mitochondria from mice following 1 month of calorie restriction. Bioscience Reports. 33, 83-95 (2013).
  21. Chacko, B. K., Kramer, P. A., Ravi, S., Benavides, G. A., Mitchell, T., Dranka, B. P., Ferrick, D., Singal, A. K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research. Clinical Science. 127, 367-373 (2014).

Play Video

Cite This Article
Rossow, H. A., Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J. Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle. J. Vis. Exp. (141), e58387, doi:10.3791/58387 (2018).

View Video