Måle leveren mitokondrie oksygenforbruk og Proton lekkasje Kinetics å anslå mitokondrie åndedrett i Holstein melkeku

Summary

Her deler vi metoder for måling mitokondrie oksygenforbruk, en definere begrepet kosttilskudd energi, og proton lekkasje, den primære årsaken til ineffektivitet i mitokondrie generasjon av ATP. Disse resultatene kan utgjør 30% av energien går tapt i næringsstoffer utnyttelse til å vurdere mitokondrie funksjon.

Abstract

Oksygenforbruk, proton motiv kraft (PMF) og proton lekkasjen er målinger av mitokondrie åndedrett, eller hvor godt mitokondrier er kjøpedyktig konvertere NADH og FADH i ATP. Siden mitochondria er også det primære området for bruk av oksygen og næringsstoffer oksidasjon karbondioksid og vann, hvor effektivt de bruker oksygen og produsere ATP direkte gjelder effektiviteten av metabolisme til næringsstoff, næringsinnhold krav for dyret, og helse av dyret. Formålet med denne metoden er å undersøke mitokondrie åndedrett, som kan brukes til å undersøke virkningene av ulike, dietter og miljømessige effekter på mitokondrie metabolismen. Resultatene omfatter oksygenforbruk målt som proton avhengige åndedrett (staten 3) og proton lekkasje avhengige respirasjon (staten 4). Forholdet mellom staten 3 / stat 4 åndedrett defineres som åndedretts kontroll forhold (RCR) og kan representere mitokondrie energisk effektivitet. Mitokondrielt proton lekkasjen er en prosess der spredning av mitokondrie membran potensial (MMP) ved uncoupling oxidative fosforylering fra ADP redusere effektiviteten av ATP syntese. Oksygen og TRMP + følsom elektroder med mitokondrie underlag og elektronet transport kjeden hemmere brukes til å måle staten 3 og staten 4 åndedrett, mitokondrie membran PMF (eller potensial til å produsere ATP) og proton lekkasje. Begrensningene til denne metoden er at leveren vev må være så frisk som mulig og alle biopsier og analyser må utføres i mindre enn 10 h. Dette begrenser antall eksempler som kan samles inn og behandles av en enkelt person i dag å ca 5. Imidlertid er bare 1 g av leveren vev nødvendig, så store dyr, for eksempel melkeku, mengden sample nødvendig er liten i forhold til leveren størrelse og det er lite utvinning tid nødvendig.

Introduction

Mitokondrier er svært følsom for stress og mobilnettet miljøet kan bidra til en rekke metabolske sykdommer. Oksygenforbruk og proton lekkasje i mitokondrier er indikatorer mitokondrier helse. Metodene som er beskrevet i dette papir estimat mitokondrie energieffektiviteten med RCR basert på oksygenforbruk med og uten proton lekkasje. Disse resultatene kan utgjør 30% av energien går tapt i næringsstoffer utnyttelse¹. Endringer i oksygen forbruk og proton lekkasjen kan identifisere mitokondrie dysfunksjon som bidrar til metabolsk sykdom og resulterer i redusert energieffektivitet. Disse metodene kan også brukes til å undersøke effekten av ulike behandlinger på mitokondrie åndedrett. Det overordnede målet med måle mitokondrie oksygenforbruk og proton lekkasje kinetics er å vurdere mitokondrie funksjon og energisk effektivitet.

Hepatic mitokondrie dysfunksjon er tilknyttet flere sykdommer i melkeku. Muligheten av cellenes stoffskifte å bytte mellom karbohydrater og lipid brensel Når møtt med en energi underskudd i tidlig amming er påvirket av antall og funksjon av mitokondrier i celle². Feil i mitokondrier evnen til å tilpasse seg en økt etterspørsel etter energi og økt β-oksidasjon kan føre til opphopning av intracellulær lipid assosiert med insulinresistens og kan føre til dannelse av fettlever i tidlig amming mjølkekyr. Mitochondria, kan som stedet for keton kroppen produksjon og bruk, spille en nøkkelrolle i ketosis i mjølkekyr³. Manglende mitokondrier eller mitokondrie dysfunksjon vil påvirke drivstoff tilgjengelighet til periferien og gjenspeiles endringer i oksygenforbruk eller RCR.

Mitokondrielt oksygen forbruk endringer i respons til betennelse. Syv dager gamle slaktekylling ble randomisert til en gruppe infisert med Eimeria maxima og en kontroll gruppe⁴. Slaktekylling som ikke gjennomførte coccidiosis utfordring hadde lavere oksygenforbruk proton lekkasje og høyere RCR indikerer at leveren mitokondrier svare på en immun utfordring ved økende proton lekkasje. Mens proton lekkasje og reaktive oksygen arter produksjon ble en gang betraktet som et tegn på mitokondrie membran dysfunksjon og skadelig for energisk effektivitet, nå det er kjent at det er viktig for import av proteiner og kalsium i mitokondrier⁵ , og for generering av varme¹.

Elektron lekkasje fra åndedretts kjeden gjør mitochondria reaktive oksygen arter produksjon og oksidative skader mitokondrie membran proteiner, lipider og Mitokondrielt DNA. Som mitokondrier alder, skade kan akkumulere spesielt til mtDNA forårsaker ytterligere dysfunksjon i mitokondrie metabolisme⁶ og større mottakelighet av kua sykdommen. I praksis fôres mange husdyr dyr høye nivåer av kosttilskudd som Cu, Zn og Mn å øke antioksidant-funksjonen. Men fôring høye nivåer av Cu, Zn og Mn redusert melk produksjon og økte oksygenopptak på grunn av proton lekkasje (staten 4 åndedrett)⁷.

Tidligere forskning rollen mitokondrie funksjon i energieffektiviteten i storfe har fokusert på endringer i mitokondrie oksygenforbruk og proton lekkasje. Svært få studier har blitt publisert i melkeku og de fleste avisene sammenligne effektivitet i form av gjenværende fôrinntak (RFI) mitokondrie funksjonen i storfe. Variasjon i mitokondrie åndedrett priser ble undersøkt av måle staten 3, staten 4 og RCR i lever fra både ammende Holstein kyr og ammende storfekjøtt kyr (Angus, Brangus og Hereford)⁸. Forskerne fant ikke noen sammenheng i mitokondrie åndedrett med vekst eller melking trekk for storfe, men rapporterte en sammenheng mellom mitokondrie åndedrett og melking trekk for Holsteins. I to studier, ble RFI sammenlignet i storfe til mitokondrie åndedrett priser (staten 3, staten 4 og RCR) i muskel mitokondrier^9,10. Mitokondrielt åndedrett tallene endret svar DMI og lave priser var assosiert med mindre effektiv biff styrer. I en annen studie, RFI av styrer fra høyt eller lavt RFI okser ble sammenlignet med mitokondrie åndedrett priser og proton lekkasje kinetics mellom de to gruppene av avkom¹¹. Det skyldtes forskjeller under vinning bekrefter konklusjonen at få gjør ikke effekten mitokondrie åndedrett i storfe.

I dette papiret, et eksperiment for å undersøke leveren RCR svar på fôring 3 antioksidant mineraler til ammende melkeku illustrerer bruken av metoder for å måle oksygenopptak ved 4 og 3 åndedrett og PMF.

Protocol

Alle metoder, protokollen og studier beskrevet her ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of California, Davis. 1. få en lever biopsi fra en Holstein melkekyr Merk: En leveren biopsi bør utføres av en med lisens veterinarian. Leveren biopsies kan utføres på meieri området der kyrne er plassert. Ammende mjølkekyr kan fortsette å bli melket normalt og melk trenger ikke å bli trukket fra matforsyningen før eller ett…

Representative Results

Positive resultater viser RCR og proton lekkasje kinetics er vist i tabell 1 og Figur 15, henholdsvis. I denne studien7, RCR og protein lekkasjen kinetics ble målt i Holstein mjølkekyr på 70 dager i melk etter kyr hadde blitt matet 1 av 5 ulike nivåer av Cu, Zn og Mn i 28 dager. Staten 4, maksimal proton lekkasje-avhengige åndedrett, hadde en tendens til å bli påvirket av mineral inntak av Cu, Mn og Zn (p </…

Discussion

Det mest kritiske punktet i protokollen er å få en representant leveren Vevsprøve og begynner isolering av mitokondrier så snart som mulig etter biopsi. Variasjon i åndedrett målinger er lav (tabell 1) på grunn av en kort tid fra kua til laboratoriet. For å redusere transporttid, lite laboratorium ble satt opp på kontoret til meieriet, og lever prøver ble kjørt til office laboratoriet som hver ble samlet inn slik at mitokondrier ble isolert i 10 min av biopsi. Oppsett og testing av åndedrett …

Materials

Liver Biopsy
Equipment
Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument	Sontec Instruments Englewood CO	1103-904
Suture	Fisher Scientific	19-037-516
Suture needles	NA	NA	Included with Suture
Scalpels	Sigma – Aldrich	S2896 / S2646	# for handle and blades
Surgery towels	Fisher Scientific	50-129-6667
Falcon tubes 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Tweezers	Sigma – Aldrich	Z168750
50 mL syringes	Fisher Scientific	22-314387
Injection needles (22, 2 1/2)	VWR	MJ8881-200342
Cow halter	Tractor Supply Co.	101966599
Cotton swabbing	Fisher Scientific	14-959-102
cotton gauze squares (4×4)	Fisher Scientific	22-246069
Medical scissors	Sigma – Aldrich	Z265969
Chemicals
Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow			Provided by Veterinarian
Clostridia Vaccine			Provided by Veterinarian
Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days			Provided by Veterinarian
Providone Scrub	Aspen Veteterinary Resources	21260221
Ethanol 70%	Sigma – Aldrich	793213
Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight			Provided by Veterinarian
2% lidocaine HCl (10-15 mL)			Provided by Veterinarian
1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine			Provided by Veterinarian
Isolation of Mitochondria (liver)
Equipment
Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance	Fisher Scientific	02-911-527
Homogenizer Motor	Cole Parmer	EW-04369-10
Homogenizer Probe	Cole Parmer	EW-04468-22
Auto Pipette (10 mL)	Cole Parmer	SK-21600-74
Beaker (500 mL) with ice	Fisher Scientific	FB100600
Refrigerated microfuge	Fisher Scientific	75-002-441EW3
Microfuge tubes (1.5 mL)	Fisher Scientific	AM12400
Chemicals
Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader)	abcam	ab102536
Sucrose	Sigma – Aldrich	S7903-1KG
Tris-HCl	Sigma – Aldrich	T1503-1KG
EDTA	Sigma – Aldrich	EDS-1KG
BSA (fatty acid free)	Sigma – Aldrich	A7030-50G
Mannitol	Sigma – Aldrich	M4125-1KG
Deionized water	Sigma – Aldrich	38796
Hepes	Sigma – Aldrich	H3375-500G
Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA,  pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator
Mitochondrial Oxygen Comsuption
Equipment
Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode	Hansatech (PP Systems)	OXY1
Thermoregulated Water Pump	ADInstruments	MLE2001
Clark type Oxygen electrode	NA	NA
Autopipette (1 mL)	Cole Parmer	SK-21600-70	Included with Oxy1
Small magnetic stir bar	Fisher Scientific	14-513-95
Micropipette (10 μL)	Cole Parmer	SK-21600-60
pH meter	VWR
Chemicals
KCl	Sigma – Aldrich	P9333-1KG
Hepes	Sigma – Aldrich	H3375-500G
KH2PO4	Sigma – Aldrich	P5655-1KG
MgCl2	Sigma – Aldrich	M1028-100ML
EGTA	Sigma – Aldrich	E3889-100G
Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA
Rotenone (4 mM solution)	Sigma – Aldrich	R8875-5G
Succinate (1 M solution)	Sigma – Aldrich	S3674-250G
ADP (100 mM solution)	Sigma – Aldrich	A5285-1G
Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol)	Sigma – Aldrich	75351
FCCP	Sigma – Aldrich	C2920
Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force
Equipment
TPMP electrode	World Precision Instruments.	DRIREF-2
Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs
Malonate (0.1 mM solution)	Sigma – Aldrich	M1296
Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer	Sigma – Aldrich	75351
Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer	Sigma – Aldrich	N7143
FCCP	Sigma – Aldrich	C3920
TPMP	Sigma – Aldrich	T200
TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA