Mätning av levern mitokondriell syreförbrukning och Proton läcka kinetik för att uppskatta mitokondriell Respiration i Holstein mjölkkor
Summary
Här delar vi metoder för att mäta mitokondriell syreförbrukning, en definiera begreppet näringsmässiga Energetik och proton läcka, den primära orsaken till ineffektivitet i mitokondriell generation av ATP. Dessa resultat kan står för 30% av den energi som förlorade näringsämnen utnyttjande för att utvärdera mitokondriefunktion.
Abstract
Syreförbrukning, proton motiv kraft (PMF) och proton läcka är mätningar av mitokondriell andning, eller hur väl mitokondrierna är konvertera NADH och Forslund till ATP. Eftersom mitokondrierna är också den primära platsen för syre och näringsämnen oxidation till koldioxid och vatten, hur effektivt de använder syre och producera ATP direkt avser effektiviteten av näringsämnen metabolism, näringsbehov av djur, och hälsa av djuret. Syftet med denna metod är att undersöka mitokondriell respiration, som kan användas för att undersöka effekterna av olika droger, kost och miljöeffekter på mitokondriell metabolism. Resultaten omfattar syreförbrukning mätt som proton beroende respiration (staten 3) och proton läcka beroende respiration (State 4). Förhållandet mellan staten 3 / statliga 4 respiration definieras som respiratorisk kontroll baserat (RCR) och kan representera mitokondriell driftig effektivitet. Mitokondriell proton läcka är en process som gör försvinnande av mitokondriella membranpotential (MMP) av uncoupling oxidativ fosforylering från ADP minskar effektiviteten i ATP-syntes. Syre och TRMP + känsliga elektroder med mitokondriell substrat och elektrontransport kedja-hämmare används för att mäta staten 3 och State 4 respiration, mitokondriella membranet PMF (eller potential att producera ATP) och proton läcka. Begränsningar av denna metod är att levern vävnad måste vara så färsk som möjligt och alla biopsier och analyser måste utföras i mindre än 10 h. Detta begränsar antalet prover som kan samlas in och bearbetas av en enda person i en dag till ca 5. Dock behövs bara 1 g av levervävnad, så stora djur, såsom mjölkboskap av provet behövs är liten i förhållande till leverns storlek och det finns lite tid för återhämtning behövs.
Introduction
Mitokondrierna är mycket känsliga för stress och deras cellulära miljön kan bidra till en mängd olika metabola sjukdomar. Syreförbrukning och proton läcka i mitokondrierna är indikatorer på mitokondrierna hälsa. De metoder som beskrivs i detta papper uppskattning mitokondriell energieffektivitet med RCR baserat på syreförbrukningen med och utan proton läcka. Dessa resultat kan står för 30% av den energi som förlorade i näringsämnen utnyttjande1. Förändringar i syre förbrukning och proton läcka kan identifiera mitokondriell dysfunktion vilket bidrar till metabola sjukdomar och resulterar i minskad energieffektivitet. Dessa metoder kan också användas för att undersöka effekten av olika behandlingar på mitokondriell respiration. Det övergripande målet för mätning av mitokondriell syreförbrukning och proton läcka kinetik är att bedöma mitokondriefunktion och driftig effektivitet.
Nedsatt mitokondriell dysfunktion har förknippats med flera sjukdomar hos mjölkkor. Cellulär metabolism förmåga att växla mellan kolhydrater och lipider bränslen inför ett energi underskott i tidig laktation påverkas av antal och funktion av mitokondrier i cell2. Defekter i mitokondrierna förmåga att anpassa sig till en ökad efterfrågan på energi och ökad β-oxidation kan leda till ansamling av intracellulära lipid associerade med insulinresistens och kan leda till bildandet av fettlever i tidig laktation mjölkkor. Mitokondrierna, kan som platsen för keton kroppen produktion och användning, spela en nyckelroll i ketos i mjölkkor3. Brist på mitokondrier eller mitokondriell dysfunktion påverkar bränsle tillgänglighet till periferin och återspeglas i förändringar i syreförbrukning eller RCR.
Mitokondriell syre förbrukning förändringar i svar på inflammation. Sju-dagsgamla slaktkycklingar lottades till en grupp som angripits av Eimeria maxima och en kontroll grupp4. Slaktkycklingar som inte genomgick koccidios utmaning hade lägre syreförbrukning på grund av proton läcka och högre RCR som anger att levern mitokondrier bemöta en immun utmaning av ökande proton läcka. Samtidigt proton läcka och reaktiva syre arter produktion ansågs en gång vara ett tecken på mitokondriella membranet dysfunktion och skadligt för energieffektivisering, nu det är känt att det är viktigt för import av proteiner och kalcium till mitokondrierna5 , och för generering av värme1.
Electron läcka från luftvägarna kedjan gör mitokondrier mottagliga för reaktivt syre arter produktion och oxidativ skada mitokondriella membranet proteiner, lipider och mitokondrie-DNA. Eftersom mitokondrierna ålder, skador kan ackumuleras särskilt till mtDNA orsakar ytterligare dysfunktion i mitokondriell metabolism6 och större känslighet av ko för sjukdom. I praktiken utfodras många djur djur höga nivåer av kosttillskott såsom Cu, Zn och Mn att öka antioxidant funktion. Dock utfodring höga nivåer av Cu, Zn och Mn minskade mjölkproduktion och ökad syreförbrukning på grund av proton läcka (State 4 respiration)7.
Tidigare forskning om rollen av mitokondriefunktion energieffektiviteten hos nötkreatur har fokuserat på förändringar i mitokondriell syreförbrukning och proton läcka. Mycket få studier har publicerats i mjölkkor och de flesta papper jämföra produktionseffektivitet i form av kvarstående foderintag (RFI) till mitokondriell funktion i köttdjur. Variabilitet i mitokondriell respiration priser undersöktes genom att mäta tillstånd 3, staten 4 och RCR i lever från både lakterande Holstein kor och digivande nötkött kor (Angus, Brangus och Hereford)8. Forskarna fann inte någon korrelation i mitokondriell andning med tillväxt eller mjölkning drag för köttdjur men gjorde rapportera en korrelation mellan mitokondriell respiration och mjölkning drag för holsteinska. I två studier jämfördes RFI i köttdjur till mitokondriell respiration klassar (staten 3, staten 4 och RCR) i muskler mitokondrier9,10. Mitokondriell respiration priser ändras som svar på DMI och låga priser var förknippade med mindre effektiva nötkött stutar. En annan studie jämfördes RFI stutar från hög eller låg RFI tjurar med mitokondriell respiration priser och proton läcka kinetik mellan de två grupperna av avkomman11. Skillnaderna var på grund av vinst bekräftar slutsatsen att vinna gör inte inverkan mitokondriell andning i köttdjur.
I detta papper, ett experiment att undersöka levern RCR svar till utfodring 3 antioxidanter mineraler till lakterande mjölkkor illustrerar användningen av metoder för att mäta syreförbrukning vid 4 och 3 respiration och PMF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den mest kritiska punkten i protokollet att få ett representativt levervävnad prov och börjar isoleringen av mitokondrierna så snart som möjligt efter biopsi. Variationen i andning mätningar är låg (tabell 1) på grund av en kort Transporttid från Ko till laboratorium. För att minska transporttiden, ett litet laboratorium inrättades kontoret för mejeriet och lever prover drevs till office laboratoriet som varje samlades så att mitokondrierna isolerades inom 10 min av biopsi. Installation och…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av Alltech och USDA lucka medel genom centrum för mat djurhälsa vid UC Davis School of Veterinary Medicine.
Materials
| Liver Biopsy | |||
| Equipment | |||
| Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument | Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
| Suture | Fisher Scientific | 19-037-516 | |
| Suture needles | NA | NA | Included with Suture |
| Scalpels | Sigma – Aldrich | S2896 / S2646 | # for handle and blades |
| Surgery towels | Fisher Scientific | 50-129-6667 | |
| Falcon tubes 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Tweezers | Sigma – Aldrich | Z168750 | |
| 50 mL syringes | Fisher Scientific | 22-314387 | |
| Injection needles (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
| Cow halter | Tractor Supply Co. | 101966599 | |
| Cotton swabbing | Fisher Scientific | 14-959-102 | |
| cotton gauze squares (4×4) | Fisher Scientific | 22-246069 | |
| Medical scissors | Sigma – Aldrich | Z265969 | |
| Chemicals | |||
| Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow | Provided by Veterinarian | ||
| Clostridia Vaccine | Provided by Veterinarian | ||
| Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days | Provided by Veterinarian | ||
| Providone Scrub | Aspen Veteterinary Resources | 21260221 | |
| Ethanol 70% | Sigma – Aldrich | 793213 | |
| Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight | Provided by Veterinarian | ||
| 2% lidocaine HCl (10-15 mL) | Provided by Veterinarian | ||
| 1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine | Provided by Veterinarian | ||
| Isolation of Mitochondria (liver) | |||
| Equipment | |||
| Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance | Fisher Scientific | 02-911-527 | |
| Homogenizer Motor | Cole Parmer | EW-04369-10 | |
| Homogenizer Probe | Cole Parmer | EW-04468-22 | |
| Auto Pipette (10 mL) | Cole Parmer | SK-21600-74 | |
| Beaker (500 mL) with ice | Fisher Scientific | FB100600 | |
| Refrigerated microfuge | Fisher Scientific | 75-002-441EW3 | |
| Microfuge tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | AM12400 | |
| Chemicals | |||
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) | abcam | ab102536 | |
| Sucrose | Sigma – Aldrich | S7903-1KG | |
| Tris-HCl | Sigma – Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma – Aldrich | EDS-1KG | |
| BSA (fatty acid free) | Sigma – Aldrich | A7030-50G | |
| Mannitol | Sigma – Aldrich | M4125-1KG | |
| Deionized water | Sigma – Aldrich | 38796 | |
| Hepes | Sigma – Aldrich | H3375-500G | |
| Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA, pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator | |||
| Mitochondrial Oxygen Comsuption | |||
| Equipment | |||
| Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode | Hansatech (PP Systems) | OXY1 | |
| Thermoregulated Water Pump | ADInstruments | MLE2001 | |
| Clark type Oxygen electrode | NA | NA | |
| Autopipette (1 mL) | Cole Parmer | SK-21600-70 | Included with Oxy1 |
| Small magnetic stir bar | Fisher Scientific | 14-513-95 | |
| Micropipette (10 μL) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
| pH meter | VWR | ||
| Chemicals | |||
| KCl | Sigma – Aldrich | P9333-1KG | |
| Hepes | Sigma – Aldrich | H3375-500G | |
| KH2PO4 | Sigma – Aldrich | P5655-1KG | |
| MgCl2 | Sigma – Aldrich | M1028-100ML | |
| EGTA | Sigma – Aldrich | E3889-100G | |
| Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
| Rotenone (4 mM solution) | Sigma – Aldrich | R8875-5G | |
| Succinate (1 M solution) | Sigma – Aldrich | S3674-250G | |
| ADP (100 mM solution) | Sigma – Aldrich | A5285-1G | |
| Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) | Sigma – Aldrich | 75351 | |
| FCCP | Sigma – Aldrich | C2920 | |
| Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force | |||
| Equipment | |||
| TPMP electrode | World Precision Instruments. | DRIREF-2 | |
| Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs | |||
| Malonate (0.1 mM solution) | Sigma – Aldrich | M1296 | |
| Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma – Aldrich | 75351 | |
| Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma – Aldrich | N7143 | |
| FCCP | Sigma – Aldrich | C3920 | |
| TPMP | Sigma – Aldrich | T200 | |
| TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
References
- Brand, M. D., Divakaruni, A. S. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26, 192-205 (2011).
- Stephenson, E. J., Hawley, J. A. Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war. Biochimica et Biophysica Acta. 1840, 1285-1294 (2014).
- Bartlett, K., Eaton, S. Mitochondrial B oxidation. European Journal of Biochemistry. 271, 462-469 (2004).
- Acetoze, G., Kurzbard, R., Klasing, K. C., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Oxygen Consumption, Respiratory Control Ratio (RCR) and Mitochondrial Proton Leak of broilers with and without growth enhancing levels of minerals supplementation challenged with Eimeria maxima (Ei). Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 101, e210-e215 (2016).
- Wallace, D. C., Fan, W. Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics. Mitochondrion. 10, 12-31 (2010).
- Paradies, G., Petrosillo, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M. Oxidative stress, mitochondrial bioenergetics and cardiolipin in aging. Free Radicals in Biology and Medicine. 48, 1286-1295 (2010).
- Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Liver mitochondrial oxygen consumption and efficiency of milk production in lactating Holstein cows supplemented with Copper, Manganese and Zinc. Journal of Animal Physiology Animal Nutrition. 102, e787-e797 (2017).
- Brown, D. R., DeNise, S. K., McDaniel, R. G. Mitochondrial respiratory metabolism and performance of cattle. Journal of Animal Science. 66, 1347-1354 (1988).
- Golden, M. S., Keisler, J. W., H, D. The relationship between mitochondrial function and residual feed intake in Angus steers. Journal of Animal Science. 84, 861-865 (2006).
- Lancaster, P. A., Carstens, G. E., Michal, J. J., Brennan, K. M., Johnson, K. A., Davis, M. E. Relationships between residual feed intake and hepatic mitochondrial function in growing beef cattle. Journal of Animal Science. 92, 3134-3141 (2014).
- Acetoze, G., Weber, K. L., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Relationship between liver mitochondrial respiration and proton leak kinetics in low and high RFI steers from two lineages of RFI Angus bulls. ISRN Vet Sci. 2015 (194014), (2015).
- Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Protection against oxidants in biological systems: The superoxide theory of oxygen toxicity. Free Radicals in Biology and Medicine. , 186-187 (1989).
- National Research Council. . Nutrient Requirements of Dairy Cattle. , (2001).
- Ramsey, J. J., Harper, M. E., Weindruch, R. Restriction of energy intake, energy expenditure, and aging. Free Radical Biology and Medicine. 29, 946-968 (2000).
- Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity: beyond ATP. Nature. 17, 608-620 (2017).
- Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. Biochemical assays of respiratory chain complex activity. Methods in Cell Biology. 80, 93-119 (2007).
- Alex, A. P., Collier, J. L., Hadsell, D. L., Collier, R. J. Milk yield differences between 1x and 4x milking are associated with changes in mammary mitochondrial number and milk protein gene expression, but not mammary cell apoptosis or SOCS gene expression. Journal of Dairy Science. 98, 4439-4448 (2015).
- Lossa, S., Lionetti, L., Mollica, M. P., Crescenzo, R., Botta, M., Barletta, A., Liverini, G. Effect of high-fat feeding on metabolic efficiency and mitochondrial oxidative capacity in adult rats. British Journal of Nutrition. 90, 953-960 (2003).
- Boily, G., Seifert, E. L., Bevilacqua, L., He, X. H., Sabourin, G., Estey, C., Moffat, C., Crawford, S., Saliba, S., Jardine, K., Xuan, J., Evans, M., Harper, M. E., McBurney, M. W. SirT1 regulates energy metabolism and response to caloric restriction in mice. PloS One. 3 (3), e1759 (2008).
- Chen, Y., Hagopian, K., Bibus, D., Villaba, J. M., Lopez-Lluch, G., Navas, P., Kim, K., McDonald, R. B., Ramsey, J. J. The influence of dietary lipid composition on liver mitochondria from mice following 1 month of calorie restriction. Bioscience Reports. 33, 83-95 (2013).
- Chacko, B. K., Kramer, P. A., Ravi, S., Benavides, G. A., Mitchell, T., Dranka, B. P., Ferrick, D., Singal, A. K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research. Clinical Science. 127, 367-373 (2014).
