Isolamento dei tilacoidi fisiologicamente attivo e il loro uso nelle analisi di trasporto energia-dipendente della proteina
Summary
Vi presentiamo protocolli qui per isolamento ad alto rendimento di tilacoidi fisiologicamente attivo e analisi di trasporto di proteina per la traslocazione di cloroplasto doppia arginina (cpTat), secretiva (cpSec1) e vie di segnale riconoscimento delle particelle (cpSRP).
Abstract
Cloroplasti sono gli organelli in piante verdi responsabile per lo svolgimento di numerose vie metaboliche essenziali, in particolare la fotosintesi. Entro i cloroplasti, il sistema a membrana tilacoide ospita tutti i pigmenti fotosintetici, complessi del centro di reazione e la maggior parte degli elementi portanti dell’elettrone ed è responsabile della sintesi di ATP di luce-dipendente. Oltre il 90% delle proteine del cloroplasto sono codificate nel nucleo, tradotta nel citosol e successivamente importati nel cloroplasto. Ulteriore trasporto di proteine in o attraverso la membrana tilacoide utilizza uno dei quattro percorsi di spostamento. Qui, descriviamo un metodo ad alto rendimento per l’isolamento di trasporto-competente tilacoidi dai piselli (Pisum sativum), insieme a saggi di trasporto attraverso le tre energia-dipendente cpTat, cpSec1 e cpSRP-ha mediato le vie. Questi metodi consentono sperimentazioni relative alla localizzazione della proteina tilacoide, trasporto energetica e i meccanismi di traslocazione di proteine attraverso le membrane biologiche.
Introduction
Quasi tutti i macchinari PROTEINICO responsabili cloroplasto corretta funzione deve essere spostati dal cytosol1. Presso le buste del cloroplasto, substrati della proteina sono importati attraverso il Traslocone della membrana esterna (TOC) e il Traslocone della membrana interna (TIC)2. Ulteriormente il targeting per il thylakoid membrana e lume si verifica attraverso la doppia arginina traslocazione (cpTat)3, il secretiva (cpSec1)4, il segnale riconoscimento delle particelle (cpSRP)5e i percorsi di inserimento spontaneo6 . Un metodo per l’isolamento ad alto rendimento dei cloroplasti fisiologicamente attivi e membrane tilacoidali è necessario misurare l’energetica e la cinetica di un evento di spostamento, per comprendere i meccanismi di trasporto diversi in ciascun percorso e per localizzare un substrato particolare proteina di interesse per uno qualsiasi dei sei comparti distinti del cloroplasto.
L’isolamento delle membrane da cloroplasto offre meglio sperimentale controllo sui fattori ambientali (quali le concentrazioni di sale e substrato, la presenza di ATP/GTP e condizioni di pH) che influenzano la misurazione dell’energetica di trasporto e cinetica. Questo ambiente in vitro si presta all’esplorazione dei dettagli meccanicistici di spostamento per gli stessi motivi. Inoltre, mentre software predittivo per la localizzazione delle proteine cloroplasto è migliorata7,8, in vitro trasporto saggi forniscono un metodo più veloce per la conferma nel corso di base di microscopia fluorescente saggi che richiedono un tag fluorescente geneticamente codificato, impianto di trasformazione e/o gli anticorpi specifici. Qui, presentiamo protocolli per isolamenti cloroplasto e tilacoidale da piselli (Pisum sativum), così come per le analisi di trasporto ottimizzate per ciascuna delle vie traslocazione thylakoid energia-dipendente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cloroplasto e tilacoidale isolamento
La rottura eccessiva può causare nel cloroplasto povero isolamento e così povero thylakoid resa dopo la separazione della sfumatura. È meglio omogeneizzare il tessuto raccolto delicatamente facendo in modo che tutto il materiale è sommerso prima di miscelazione e pulsare in 15 cicli di s fino a quando completamente omogeneizzato. Se necessario, utilizzare più cicli più brevi di miscelazione con meno tessuto in ogni round.
Tutt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo manoscritto è stato preparato con finanziamento da parte della divisione di scienze chimiche, Geoscienze e Biosciences, 408 ufficio energia delle scienze di base del dipartimento di energia attraverso Grant DE-SC0017035
Materials
| Pisum sativum seeds | Seedway LLC, Hall, NY | 8686 – Little Marvel | |
| Miracloth | Calbiochem, Gibbstown, NJ | 475855-1 | |
| 80% Acetone | Sigma, Saint Louis, MO | 67-64-1 | |
| Blender with sharpened blades | Waring Commercial | BB155S | |
| Polytron 10-35 | Fischer Sci | 13-874-617 | |
| Percoll | Sigma, Saint Louis, MO | GE17-0891-01 | |
| Beckman J2-MC with JA 20 rotor | Beckman-Coulter | 8043-30-1180 | |
| Sorvall RC-5B with HB-4 rotor | Sorvall | 8327-30-1016 | |
| 100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 12/3/83 | Can be frozen in aliquots for future use |
| 200 mM MgATP in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 74804-12-9 | Can be frozen in aliquots for future use |
| Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) | Sigma, Saint Louis, MO | 9073-78-3 | Can be frozen in aliquots for future use |
| HEPES | Sigma, Saint Louis, MO | H3375 | |
| K-Tricine | Sigma, Saint Louis, MO | T0377 | |
| Sorbitol | Sigma, Saint Louis, MO | 50-70-4 | |
| Magnesium Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 7791-18-6 | |
| Manganese Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 13446-34-9 | |
| EDTA | Sigma, Saint Louis, MO | 60-00-4 | |
| BSA | Sigma, Saint Louis, MO | 9048-46-8 | |
| Tris | Sigma, Saint Louis, MO | 77-86-1 | |
| SDS | Sigma, Saint Louis, MO | 151-21-3 | |
| Glycerol | Sigma, Saint Louis, MO | 56-81-5 | |
| Bromophenol Blue | Sigma, Saint Louis, MO | 115-39-9 | |
| B-Mercaptoethanol | Sigma, Saint Louis, MO | 60-24-2 |
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