Vi præsenterer protokoller heri til højtydende isolation af fysiologisk aktive tylakoiderne og protein transport assays til grønkorn twin arginin translokation (cpTat), sekretorisk (cpSec1) og signal anerkendelse partikel (cpSRP) veje.
Kloroplaster er organelles i grønne planter forestår mange væsentlige stofskifteveje, især fotosyntese. I grønkornene, tylakoid membran system huse alle de fotosyntetiske pigmenter, reaktion center komplekser og de fleste af elektron luftfartsselskaber, og er ansvarlig for lys-afhængige ATPsyntesen. Over 90% af grønkorn proteiner er kodet i kernen, oversat i cytosol og efterfølgende importeres til chlorplasttransitpeptidsekvensen. Yderligere protein transport ind eller tylakoidmembranen udnytter en af fire translokation veje. Her, beskriver vi en højtydende metode til isolation af transport-kompetente tylakoiderne fra ærter (Pisum sativum), sammen med transport assays gennem tre energiafhængige cpTat, cpSec1 og cpSRP-medieret veje. Disse metoder aktiverer eksperimenter vedrørende tylakoid protein lokalisering, transport energetik og mekanismer for protein translokation over biologiske membraner.
Næsten alle de proteinholdige maskiner ansvarlig for korrekt grønkorn funktion skal omplantes fra cytosol1. På grønkorn konvolutter, er protein substrater importeret gennem translocon af den ydre membran (TOC) og translocon i den indre membran (TIC)2. Yderligere målretning til tylakoid sker membran og lumen gennem twin arginin translokation (cpTat)3, sekretorisk (cpSec1)4, signal anerkendelse partikel (cpSRP)5og spontane indsættelse veje6 . En metode til højtydende isolering af fysiologisk aktive grønkorn og tylakoid membraner er nødvendigt at måle energetik og kinetik af en translokation begivenhed, at forstå de forskellige transportmekanismer på hver vej og lokalisere en bestemt protein substrater af interesse for nogen af de seks særskilte rum af chlorplasttransitpeptidsekvensen.
Isolering af membraner fra chlorplasttransitpeptidsekvensen tilbyder bedre eksperimentelle kontrol over miljømæssige faktorer (såsom salt og substrat koncentrationer, tilstedeværelsen af ATP/GTP og pH betingelser), der påvirker målingen af transport energetik og kinetik. Denne in vitro- miljø egner sig til udforskning af mekaniske detaljer af translokation af de samme grunde. Desuden, mens intelligent software til lokalisering af grønkorn proteiner har forbedret7,8, giver in vitro- transport assays en hurtigere metode til bekræftelse over mikroskopi-baserede fluorescerende assays kræve en genetisk kodet fluorescerende tag, plante transformation og/eller specifikke antistoffer. Vi præsenterer her, protokoller for grønkorn og tylakoid isolering fra ærter (Pisum sativum) samt for transport assays optimeret til hver af de energi-afhængige tylakoid translokation veje.
Grønkorn og tylakoid isolation
Overdreven brud kan resultere i dårlig grønkorn isolation og dermed dårlig tylakoid udbytte efter separation i farveforløbet. Det er bedst at homogenisere de høstede væv forsigtigt ved at sikre, at alt materiale er neddykket før blanding og pulserende i 15 s cykler indtil fuldt homogeniseret. Hvis det er nødvendigt, bruge flere kortere runder af blanding med mindre væv i hver runde.
Køle alle materialer, der kommer i kontakt me…
The authors have nothing to disclose.
Dette håndskrift blev udarbejdet med finansiering af Division af kemiske videnskaber, Geosciences og biovidenskab, 408 Office af energi Grundvidenskab af os Department of Energy gennem Grant DE-SC0017035
Pisum sativum seeds | Seedway LLC, Hall, NY | 8686 – Little Marvel | |
Miracloth | Calbiochem, Gibbstown, NJ | 475855-1 | |
80% Acetone | Sigma, Saint Louis, MO | 67-64-1 | |
Blender with sharpened blades | Waring Commercial | BB155S | |
Polytron 10-35 | Fischer Sci | 13-874-617 | |
Percoll | Sigma, Saint Louis, MO | GE17-0891-01 | |
Beckman J2-MC with JA 20 rotor | Beckman-Coulter | 8043-30-1180 | |
Sorvall RC-5B with HB-4 rotor | Sorvall | 8327-30-1016 | |
100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 12/3/83 | Can be frozen in aliquots for future use |
200 mM MgATP in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 74804-12-9 | Can be frozen in aliquots for future use |
Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) | Sigma, Saint Louis, MO | 9073-78-3 | Can be frozen in aliquots for future use |
HEPES | Sigma, Saint Louis, MO | H3375 | |
K-Tricine | Sigma, Saint Louis, MO | T0377 | |
Sorbitol | Sigma, Saint Louis, MO | 50-70-4 | |
Magnesium Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 7791-18-6 | |
Manganese Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 13446-34-9 | |
EDTA | Sigma, Saint Louis, MO | 60-00-4 | |
BSA | Sigma, Saint Louis, MO | 9048-46-8 | |
Tris | Sigma, Saint Louis, MO | 77-86-1 | |
SDS | Sigma, Saint Louis, MO | 151-21-3 | |
Glycerol | Sigma, Saint Louis, MO | 56-81-5 | |
Bromophenol Blue | Sigma, Saint Louis, MO | 115-39-9 | |
B-Mercaptoethanol | Sigma, Saint Louis, MO | 60-24-2 |