생리 적으로 활성 Thylakoids 및 에너지 의존 단백질 수송 분석 실험에 있는 그들의 사용의 격리

Summary

선물이 여기 순수 active thylakoids의 높은 수율 격리에 대 한 프로토콜 및 엽록체 트윈 아르기닌 전 (cpTat), 분 비 (cpSec1), 및 신호 승인 입자 (cpSRP) 경로 대 한 단백질 전송 분석 실험.

Abstract

엽록체는 녹색 식물 수많은 필수 대사 경로, 수행에 대 한 책임에서 세포 특히 광합성. 엽록체, 내 thylakoid 막 시스템 모든 광합성 안료, 반응 센터 복합물, 및 전자 통신 사업자의 대부분 이며 빛 종속 ATP 합성에 대 한 책임. 엽록체 단백질의 90% 이상 핵에서 인코딩, cytosol, 번역 이며 이후에 엽록체를 가져올. 추가 단백질 전송 또는 thylakoid 막에 걸쳐 4 전 경로 중 하나를 사용합니다. 여기, 우리 3 에너지 종속 cpTat, cpSec1, 및 cpSRP 중재 경로 통해 전송 분석 함께 완두콩 (Pisum sativum)에서 전송 유능한 thylakoids의 격리에 대 한 높은 수확량 메서드를 설명합니다. 이러한 메서드를 실험 생물학 막에 걸쳐 thylakoid 단백질 지 방화, 교통에 너 지론, 그리고 단백질 전 좌의 메커니즘에 관련 된 사용.

Introduction

배치할 기계 적절 한 엽록체 기능에 대 한 책임의 거의 모든 cytosol¹translocated 해야 합니다. 엽록체 봉투에서 단백질 기판의 외부 막 (TOC) translocon와 내부 막 (TIC)²의 translocon를 통해 가져올 수 있습니다. 더는 thylakoid에 타겟팅 막과 루멘 트윈 아르기닌 전 (cpTat)³,⁴분 비 (cpSec1), 신호 승인 입자 (cpSRP)⁵, 그리고 자발적인 삽입 경로^{6 통해 발생} . 순수 활성 엽록체 및 thylakoid 막의 높은 수율 격리에 대 한 메서드는 필요한에 너 지론과 전 이벤트, 각 통로에 다양 한 전송 메커니즘을 이해 하 고 지역화의 활동을 측정 하는 엽록체의 6 가지 구획에 관심의 특정 단백질 기질.

더 나은 실험 제어 전송에 너 지론의 측정에 영향을 주는 환경 요인 (예: 소금, 기질 농도, pH 조건과 ATP/GTP의 존재)를 제공 하는 엽록체에서 막의 분리 및 속도 론입니다. 이 체 외에서 환경에 빌려준....

Protocol

1. 초기 자료

1. 완두콩의 약 55 g 400 ml 증류수, 3 시간 담근 다 고 다음 플라스틱 쟁반에 뿌리 다 (35 cm x 20 cm x 6 cm) 질 석의 얇은 층으로 덮여 토양에.
2. 9 ~ 15 일에 대 한 12/12 h 명암 (50 µE/m²s) 주기에서 20 ° C에서 완두콩의 트레이 성장.
3. 선호 하는 방법에 따라 단백질 기질을 준비 합니다.
   참고: 우리는 다양 한 1 등 하는 방법 사용 하 여 단백질 기판 준비) 순화 된 플라스 미드에서 녹음 방송 생체 외에서 다음 밀 배아 추출 물 또는 토끼 reticulocyte lysates [³H]의 존재를 사용 하 여 번역-신 또는 [³⁵S]-메티오닌, 2) TnT 같은 결합 된 전사/번역 키트를 사용 하 여 체 외에서 번역 Promega radiolabeling 위에서, 함께 그리고 3에서 키트) 대장균에 overexpressed 단백질의 정화. 번역 제품 방사성 체 외에 일반적으로 50 m m 감기 아미노산 전송 반응에서 사용 하기 전에 침묵 된다. 이러한 각 메서드는 일반적으로 각 새로운 단백질 기질에 대 한 몇 가지 최적화를 필요합니다. 결합 된

Results

성공적으로 수송 하는 기판의 크기를 측정 하기 위해 하나 이상의 "백분율 입력" 차선을 포함 하도록 유용 합니다. 아래 제시 하는 데이터에 대 한 마지막 전송 반응 없이 thylakoids의 10% 사용 되었다. 이 "백분율 입력" 또한 전조 기판의 크기를 시각화 하는 데 도움이. 비율에 대 한 수송 비교 기판에는 기판의 알려진, 정의 된 금액을 나타내고 단백질 준비 필요한 사용 하 여 처음으로 위 또는 아래로 확장할 수 있습니다. 또한, 그것은 0.75 m m polyacrylamide 젤을 피하기 위해 밴드를 휘게 하 고 번짐에 하나의 차선에서 Chl 등가물의 미만 4 µ g를 로드 하는 것이 좋습니다. 모든 기판 아래 준비 했다 하 고 생체 외에서 번역 키트를 사용 하 여 방사선.

CpTat 통로 통해 iOE17의 전송

Discussion

엽록체 및 Thylakoid 절연

과도 한 파손 될 수 있습니다 가난한 엽록체에서 격리 하 고 따라서 가난한 thylakoid에서에서 분리 후 항복. 그것은 모든 재료 혼합 및 완전히 무 균 때까지 15 s 사이클에서 펄스 전에 침수는 함으로써 부드럽게 수확된 조직 균질 최고의. 필요한 경우 여러 개의 짧은 라운드의 각 라운드에서 적은 조직으로 혼합 사용 합니다.

수확된 조직을 접촉 하는 모든 자료를 냉동 2 시간 최대 활동을 유지 하기 위해 고립 된 엽록체 수 있습니다. 그것은 또한 격리 후 어둠 속에서 얼음에 엽록체를 유지 하는 것이 중요입니다.

그것은 고립 된 thylakoids를 접촉 하는 버퍼에 마그네슘을 포함 하도록 중요 합니다. 이렇게 하지 않는 granal destacking 귀착되 고 비판적으로 조명²¹위에 양성자 동기 힘의 생.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pisum sativum seeds	Seedway LLC, Hall, NY	8686 - Little Marvel
Miracloth	Calbiochem, Gibbstown, NJ	475855-1
80% 아세톤	시그마, 세인트루이스, MO	67-64-1
날카로운 칼날이 있는 블렌더	Waring Commercial	BB155S
Polytron 10-35	Fischer Sci	13-874-617
Percoll	Sigma, Saint Louis, MO	GE17-0891-01
Beckman J2-MC with JA 20 rotor	Beckman-Coulter	8043-30-1180
Sorvall RC-5B with HB-4 rotor	Sorvall	8327-30-1016
100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB	Sigma, Saint Louis, MO	12/3/83	향후 사용을 위해 분취량에서 동결 가능
1xIB에서 200 mM MgATP	Sigma, Saint Louis, MO	74804-12-9	향후 사용을 위해 부분 표본에 동결 가능
1xIB (2mg/mL)Sigma	, Saint Louis, MO	9073-78-3	향후 사용을 위해 부분 표본에 동결 가능
HEPES	Sigma, Saint Louis, MO	H3375
K-Tricine	Sigma, Saint Louis, MO	T0377
소르비톨	시그마, Saint Louis, MO	50-70-4
염화마그네슘	시그마, 세인트루이스, MO	7791-18-6
염화망간	시그마, 세인트루이스, MO	13446-34-9
EDTA	시그마, 세인트루이스, MO	60-00-4
BSA	시그마, 세인트루이스, MO	9048-46-8
트리스	시그마, 세인트루이스, MO	77-86-1
SDS	시그마, 세인트루이스, MO	151-21-3
글리세롤	시그마, 세인트루이스, MO	56-81-5
브로모페놀 블루	시그마, 세인트루이스, MO	115-39-9
B-메르캅토에탄올	시그마, 세인트루이스, MO	60-24-2