Vi presenterer protokoller her for høy avkastning isolering av fysiologisk aktiv thylakoids og protein transport analyser for chloroplast twin arginine translokasjon (cpTat), sekretoriske (cpSec1) og signal anerkjennelse partikkel (cpSRP) stier.
Chloroplasts er organelles i grønne planter ansvarlig for gjennomføring av mange viktige metabolske veier, spesielt fotosyntese. Chloroplasts, thylakoid membran systemet huser alle fotosynteseaktiviteten pigmentene, reaksjon center komplekser og de fleste av elektron bærere og er ansvarlig for lys-avhengige ATP syntese. Over 90% av chloroplast proteiner er kodet i kjernen, oversatt i stoffer, og deretter importeres til chloroplast. Ytterligere protein transport i eller over thylakoid membranen benytter en av fire translokasjon. Her beskriver vi en høy dekkevne metode for isolering av transport-kompetent thylakoids fra erter (Parlamentarisme sativum), samt transport analyser gjennom tre energi avhengig av cpTat, cpSec1 og cpSRP-mediert trasé. Disse metodene at eksperimenter vedrørende thylakoid protein lokalisering og transport energi mekanismer av protein translokasjon over biologiske membraner.
Nesten alle proteinaceous maskiner ansvarlig for riktig chloroplast-funksjonen må være translocated fra stoffer1. På chloroplast konvoluttene importeres protein underlag gjennom translocon av den ytre membranen (Innholdsfortegnelsen) og translocon av indre membran (TIC)2. Videre målretting for thylakoid skjer membran og lumen gjennom twin arginine translokasjon (cpTat)3, sekretoriske (cpSec1)4, signalet anerkjennelse partikkel (cpSRP)5og spontan innsetting veier6 . En metode for høy avkastning isolering av fysiologisk aktive chloroplasts og thylakoid membraner er nødvendig for å måle energi og kinetics av en translokasjon hendelse, forstår de forskjellige transportmekanismene i hver veien og lokalisere en spesielle proteinet substrat av interesse for noen av de seks forskjellige avdelinger av chloroplast.
Isolasjon av membraner fra chloroplast gir bedre eksperimentelle kontroll over miljøfaktorer (for eksempel salt og underlaget konsentrasjoner, ATP/GTP, og pH forhold) som påvirker måling av transport energi og Kinetics. Dette i vitro miljø gir seg til utforskning av mekanistisk detaljer om translokasjon av samme grunn. I tillegg, mens prognosen programvare for lokalisering av chloroplast proteiner har forbedret7,8, gir i vitro transport analyser en raskere metode for bekreftelse over mikroskopi-baserte fluorescerende analyser som kreve en genetisk kodet fluorescerende kode, plante transformasjon og/eller spesifikke antistoffer. Her presenterer vi protokoller for chloroplast og thylakoid isolasjoner fra erter (Parlamentarisme sativum) og transport analyser optimalisert for hver av energi-avhengige thylakoid translokasjon veier.
Chloroplast og Thylakoid isolasjon
Overdreven brudd kan resultere i dårlig chloroplast isolasjon og dårlig thylakoid kapasitet etter separasjonen i forløpningen. Det er best å homogenize høstet vevet forsiktig ved å sikre at alt materiale er neddykket før blanding og pulserende i 15 s sykluser til fullt homogenisert. Om nødvendig kan du bruke flere kortere runder blanding med mindre vev i hver runde.
Kjøle alle materialer som kommer i kontakt med høstet vev h…
The authors have nothing to disclose.
Dette manuskriptet var forberedt med finansiering av Division of kjemiske Sciences, Geofag og biovitenskap, 408 kontoret til energi basalfag av oss Department of Energy gjennom Grant DE-SC0017035
Pisum sativum seeds | Seedway LLC, Hall, NY | 8686 – Little Marvel | |
Miracloth | Calbiochem, Gibbstown, NJ | 475855-1 | |
80% Acetone | Sigma, Saint Louis, MO | 67-64-1 | |
Blender with sharpened blades | Waring Commercial | BB155S | |
Polytron 10-35 | Fischer Sci | 13-874-617 | |
Percoll | Sigma, Saint Louis, MO | GE17-0891-01 | |
Beckman J2-MC with JA 20 rotor | Beckman-Coulter | 8043-30-1180 | |
Sorvall RC-5B with HB-4 rotor | Sorvall | 8327-30-1016 | |
100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 12/3/83 | Can be frozen in aliquots for future use |
200 mM MgATP in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 74804-12-9 | Can be frozen in aliquots for future use |
Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) | Sigma, Saint Louis, MO | 9073-78-3 | Can be frozen in aliquots for future use |
HEPES | Sigma, Saint Louis, MO | H3375 | |
K-Tricine | Sigma, Saint Louis, MO | T0377 | |
Sorbitol | Sigma, Saint Louis, MO | 50-70-4 | |
Magnesium Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 7791-18-6 | |
Manganese Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 13446-34-9 | |
EDTA | Sigma, Saint Louis, MO | 60-00-4 | |
BSA | Sigma, Saint Louis, MO | 9048-46-8 | |
Tris | Sigma, Saint Louis, MO | 77-86-1 | |
SDS | Sigma, Saint Louis, MO | 151-21-3 | |
Glycerol | Sigma, Saint Louis, MO | 56-81-5 | |
Bromophenol Blue | Sigma, Saint Louis, MO | 115-39-9 | |
B-Mercaptoethanol | Sigma, Saint Louis, MO | 60-24-2 |