Sanntid kvantitative polymerase kjedereaksjon analyse kombinert med omvendt transkripsjon (RT-qPCR) har vært mye brukt til å måle nivået av RNA virusinfeksjoner. Her presenterer vi en direkte RT-qPCR analysen, som ikke krever en RNA rensing trinn, utviklet for kvantifisering av flere RNA-virus, inkludert dengue virus.
I dag, sanntid polymerase kjedereaksjon (PCR) teknologien er et uunnværlig verktøy for deteksjon og kvantifisering av viral genomer i forskningslaboratorier og molekylære diagnose, på grunn av sin følsomhet, spesifisitet, og bekvemmelighet. Men i de fleste tilfeller kvantitative PCR (qPCR) analysen vanligvis brukes til å oppdage virusinfeksjon har stolt på rensing av viral nukleinsyre før PCR-trinn. I denne studien utvikles fluorescens-baserte omvendt transkripsjon qPCR (RT-qPCR) analysen gjennom en kombinasjon av en behandling buffer og en ettrinns RT PCR reagens slik at hele prosessen, fra avlingen av kultur nedbryting av virusinfiserte celler til deteksjon i sanntid, kan utføres uten viral RNA rensing. Etablerte protokollen gjør det mulig for kvantifisering av et bredt spekter av RNA konsentrasjoner av dengue virus (DENV) innen 90 min. I tillegg er tilpasningsevne direkte RT-qPCR analysen til evalueringen av en antiviral agent demonstrert ved en i vitro eksperimentere med en tidligere rapporterte DENV hemmer, mycophenolic syre (MPA). Videre kan andre RNA-virus, inkludert gulfeber virus (YFV), Chikungunya virus (CHIKV) og meslinger viruset (MeV), kvantifiseres av direkte RT-qPCR med samme protokoll. Derfor er direkte RT-qPCR analysen beskrevet i denne rapporten nyttig for overvåking RNA-virus replikering i en enkel og rask måte, som vil bli videreutviklet til en lovende plattform for en høy gjennomstrømming screening-undersøkelse og klinisk diagnose.
Slekten Flavivirus av Flaviviridae familie består av mer enn 70 innhyllet, positiv-strandet RNA virus som overføres av mygg og flått. Viktigere, fører flavivirus infeksjon hos mennesker ofte til alvorlig klinisk sykdom, for eksempel hemoragisk feber og encefalitt1. Faktisk en siste utbruddet av Zika viruset (ZIKV), en flavivirus, spredd eksplosivt i hele Amerika og har vist seg å være assosiert med nevrologiske komplikasjoner, inkludert microcephaly2,3. Flaviviruses, har derfor betydelig kliniske og økonomisk innvirkning på moderne samfunn.
En viktig flavivirus er dengue virus (DENV), en mygg-borne virus vidt distribuert i tropiske og subtropiske områder av verden. DENV overføres av Aedes mygg, inkludert Aedes albopictus og Aedes aegypti, noe som resulterer i global spredning av dengue utbrudd4. Foreløpig World Health Organization (WHO) klassifiserer dengue sykdom som tre kategorier: dengue uten varselsignaler, Venezuela varselsignaler og alvorlig dengue4. Selv om primær infeksjon med en av de fire serotypene av DENV (DENV-1-4) er ofte asymptomatisk eller selvbegrensende, har Epidemiologiske studier vist at sekundær infeksjon av ulike serotyper øker risikoen for mer alvorlige former for dengue. Det er verdt å merke seg at antistoff avhengige forbedring av DENV infeksjon forårsaket av ikke – eller subneutralizing antistoffer produsert i primære infeksjonen har blitt foreslått som en potensiell mekanisme av alvorlig dengue som skjedde som sekundær infeksjon. Imidlertid er ingen bestemt antiviral stoffet tilgjengelig for DENV infeksjon5.
For utvikling av antivirale midler mot DENV er rutine og robuste analyser, som er mottakelig for en høy gjennomstrømming innstilling, avgjørende for å oppdage virus replikering kvantitativt. Konvensjonelt, har biologiske metoder (f.eks, plakk analysen) for kvantifisering smittsomme virus og immunologiske analyser (f.eksenzym knyttet immunosorbent analysen [ELISA]) for å oppdage virus antigener blitt brukt til å overvåke DENV replikering i vitro og vivo6,7. Men disse analyser er ofte arbeidskrevende og krever flere dager å fullføre, som hindrer håndtering av store antall prøver. I denne forbindelse RT-qPCR er en pålitelig analysen for å oppdage DENV infeksjon: det er bestemt, følsom og relativt rask7. I tillegg har RT-qPCR teknikken flere fordeler i høy gjennomstrømming format. Likevel krever typisk prosedyren for RT PCR RNA-virus utvinning av viral nukleinsyrer fra innsamlede eksemplene. Selv om ulike metoder for utvinning kan være ansatt for RT-qPCR, er flere trinn fortsatt behov for å få renset viral RNA. Også krever RT-qPCR analyser vanligvis dyrt spinn kolonner eller farlige organiske løsemidler, og dermed gjør forberedelsesprosessen mer tungvint. Siden unngå mishandling og/eller krysskontaminering mellom prøvene er en kritisk faktor for vellykket kvantifiseringen av viral genomer, er en mindre arbeidskrevende og tidkrevende metode foretrukket, spesielt hvis RT-qPCR er på høy gjennomstrømming format.
Her rapporterer vi et enkelt RT-qPCR prosedyre for å måle DENV RNA i en kultur nedbryting av infiserte celler som ikke involverer viral RNA rensing. Denne optimaliserte RT-qPCR protokollen består av to trinn: i) inkubasjonstiden for en nedbryting av DENV-infiserte cellekultur med behandling buffer og ii) ettrinns RT-qPCR på en sanntid PCR-instrument. Følgelig kan DENV RNA i en kultur supernatant oppdages innen 90 min (figur 1). Vi beskriver også bruk av den direkte RT-qPCR til andre RNA virusinfeksjoner.
I dag, blir viral nukleinsyre gjenkjenning av fluorescerende-baserte sanntid PCR en gull-standard for molekylær diagnostisering av patogene menneskelig virus, på grunn av sin følsomhet og hurtighet7. Dette er spesielt viktig for bekrefter virusinfeksjon i den tidlige fasen av akutt smittsomme sykdommer som denguefeber17. Også innen grunnforskning DNEV er RT-qPCR analysen et uunnværlig verktøy for overvåking virus replikering i i vitro kultur, som vil føre til en forståelse av replikering biologi av DENV og oppdagelsen av antivirale hemmere. I denne studien ble fluorescerende-baserte sanntid PCR analysen videreutviklet av en kombinasjon av en behandling buffer og en ettrinns RT PCR reagens slik at DENV RNA i kultur nedbryting av infiserte celler kunne kvantifiseres av RT-qPCR uten rensing viral RNA genomet. Sammenlignet med rutinemessig analyser å oppdage virus replikering, som plakk analysen, ELISA eller konvensjonelle RT-qPCR ansette RNA rensing6,7, forenklet protokollen RT-qPCR analysen resulterte i en stor reduksjon av tiden og trinnene som er nødvendig å kvantifisere DENV RNA. Dette er også en viktig funksjon som har fordeler i å redusere forurensning og tap av genetisk materiale. Det bør imidlertid bemerkes at bruk av en ren hette er avgjørende i oppsett av IVT (trinn 2.1) og RT-qPCR (trinn 4.1-4.4) reaksjoner å unngå kryss-kontaminering av amplicon-relaterte produkter eller RNase. Det er også avgjørende for å håndtere kulturen supernatant, inkludert smittsomme virus, inne en biosafety kabinett (trinn 3.3) å redusere fare for laboratoriet infeksjon.
En annen betydningen av direkte RT-qPCR analysen er at en rekke viral RNA kopier kan analyseres samtidig uten fortynning eller konsentrasjon av prøven. Når en serielt utvannet DENV 3 UTR RNA standard ble brukt, direkte RT-qPCR protokollen produsert en lineær standardkurve syv størrelsesordener, og den nedre grensen for kvantifisering var 500 RNA eksemplarer (figur 2). For deteksjon av DENV i kultur nedbryting av infiserte celler, 8 x 103 til 8 x 10-2 PFU virus i en 10 μL RT-qPCR var innen rekkevidde av DENV 3 UTR RNA standarden, og den nedre grensen for påvisning (8 x 10-2 PFU) ble beregnet inneholder 11 , 400 ± 7,077 RNA kopier (figur 3B). Av notatet, som rapportert i flere flavivirus studier18,19,20, ble større forholdet mellom viral RNA kopi av virus smittsomme titer (dvs., PFU) i DENV prøver også observert i denne studien. Denne overvurdering antas for å være hovedsakelig på grunn av defekt (dvs.ikke-smittsomme) virus eller gratis viral RNA løslatt fra infiserte og døde celler. Selv om forholdet mellom RNA Kopier: PFU innhentet i denne studien (1.1 x 105 til 1,3 x 105 RNA Kopier/PFU) var inkonsekvent med dataene vist tidligere (prosenter varierer fra 1 til 3 logg)21,20, kan dette være tilskrevet forskjellen i viruset stammer, celler eller oppdrettsforholdene ansatt. En annen sannsynlig forklaring for avviket er at siden ingen RNA renselsesprosess var involvert i direkte RT-qPCR analysen beskrevet her, kan flere DENV RNA i kultur nedbryting registreres i sanntid PCR analyse uten tap av viral genetisk materiale.
Enkelheten av den direkte RT-qPCR forbedrer evnen til å håndtere et stort antall prøver i flere godt formater, for eksempel en 96-brønns plate. Derfor vil denne egenskapen hjelpe fremtidige anvendelsen av direkte RT-qPCR analysen til en høy gjennomstrømming screening-undersøkelse for å anti-DENV narkotika. Faktisk, i denne rapporten, bruk av direkte RT-qPCR analysen for å validere en anti-DENV hemmer, MPA, ble undersøkt, og resultatet viste at en IC50 verdien av MPA ved direkte RT-qPCR analysen (Figur 4) var sammenlignes rapportert i tidligere studier med plakett analysen12,13. Dette viser at direkte RT-qPCR er en nyttig analysen for riktig vurderer den hemmende effekten av antivirale midler og kan adoptert i en narkotikarelaterte screening studie i fremtiden.
I denne studien ble det gjort forsøk å bruke den direkte RT-qPCR gjenkjenning av andre RNA-virus. Som vist i figur 5, når 10 ganger fortynninger av tre andre RNA virus (YFV, CHIKV og MeV) klassifisert i ulike genera (Flaviviridae, Togaviridaeog Paramyxoviridae, henholdsvis) ble undersøkt ved hjelp av tidligere sonder rapporterte primere og fluorogenic gjelder for de respektive viral RNA sekvensene. God sammenhenger mellom smittsomme titers og Ct ble oppnådd ved direkte RT-qPCR analyser, og sammenhenger var 4-6 lineær størrelsesordener. Dette tyder på at direkte RT-qPCR protokollen er tilpasningsdyktig til ulike typer RNA-virus ved å endre virus-spesifikke primerne og fluorogenic sonder.
Likevel følsomheten av variert blant virus testet i denne studien (figur 5). En endring av protokollen som kan forbedre gjenkjenning av målet virus RNA skal bruke et nytt sett med primer/sonde sekvenser. I tillegg er et viktig skritt for vellykket direkte RT-qPCR analysen antatt å være effektiv utgivelsen av viral genomet under prøven behandlingstrinn (trinn 3.1-3.4). Dette vil være spesielt viktig for kvantitative påvisning av stabil virus som et ikke-innhyllet virus. Selv som en innledende forsøket, Coxsackievirus B3 (CVB3), et ikke-innhyllet RNA-virus tilhører Picornaviridae, ble utsatt for direkte RT-qPCR analysen med tidligere beskrevet CVB3-spesifikke primere og fluorescerende sonde22, en positiv amplicon signalet ikke kunne avklares selv med en høy-titer (1 x 105 PFU/mL) virus lager. Dette anses å være i stor grad tilskrives høy fysiske integriteten til ikke-innhyllet virus. Så langt, noen RT PCR analyser som ikke krever rensing av nukleinsyre er utviklet for å oppdage flere RNA-virus, som benytter ulike protokoller i RNA utgivelsen trinn23,24,25, 26. dermed bruk av de alternative (eller flere) behandlingene, for eksempel en inkubasjonstiden for et virus utvalg ved høy temperatur, potensielt øker følsomheten til gjenkjenning.
Oppsummert var direkte RT-qPCR protokollen utviklet i denne studien en enkel og rask, men pålitelig metode for kvantifisere viral RNA i en kultur nedbryting av infiserte celler. På grunn av denne enkelhet, kan direkte RT-qPCR analysen behandle en rekke prøver på kort tid, som holder løftet for høy gjennomstrømming analyse av virus replikering. Videre ble bruk av direkte RT-qPCR protokollen til andre RNA-virus også demonstrert. Denne tilnærmingen bør derfor være et nyttig verktøy for effektiv overvåking RNA-virusinfeksjoner i forskning laboratorium omgivelser og, muligens i klinisk diagnoser.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Subhash G. Vasudevan (Duke-NUS utdannet Medical School, Singapore) for den DENV-2 isolere EDEN2 3295 og Shunro Imura (Kobe karantene Station, Japan) for YFV 17D vaksine belastning. Forfatterne er også takknemlige til instituttet for mikrobiologi og infeksjonskontroll medlemmer for deres hjelp. Dette arbeidet er støttet av MEXT KAKENHI Grant nummer JP16737900.
PrimeSTAR Max DNA Polymerase | Takara Bio. Inc | R045A | Comparable PCR reagent kit can be used. |
SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | Comparable thermal cycler instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
6x Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7024S | Comparable gel loading dye can be used. |
2-Log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200 | 0.1-10.0 kilobase pairs. Comparable DNA molecular ladder can be used. |
Gel Scene Tablet | Astec | GST-33 | Comparable gel imaging system can be used. |
illustra GFX PCR Purification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 28-9034-70 | Comparable gel extraction kit can be used. |
BioSpectrometer | Eppendorf | 6135000905 | Comparable spectrophotometer can be used. |
MEGAscrip T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1334 | |
TURBO DNase | Thermo Fisher Scientific | AM2238 | Included in MEGAscrip T7 Transcription Kit. |
Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio. Inc | 2313A | 40 units/μL |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Comparable RNA purification kit can be used. |
CellAmp Direct RNA Prep Kit | Takara Bio. Inc | 3733Q | |
Proteinase K | Nacalai Tesque | 15679-06 | > 600 units/mL. Comparable reagent can be used. |
iTaq Universal Probes One-Step Kit | Bio-Rad | 1725141 | |
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | Comparable plate or tube can be used dependent on the real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Comparable film or optical cap can be used dependent on the real-time PCR plate or tube. |
StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | StepOnePlus-01 | Comparable real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |