عزل نويات الحبل الشوكي الكبار لتسلسل الحمض النووي الريبي المفرد-نواة موازية على نطاق واسع
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لسرعة عزل نواة عالية الجودة من الأنسجة الطازجة أو المجمدة المصب تسلسل الحمض النووي الريبي موازية على نطاق واسع. نحن تشمل الأنسجة الميكانيكية والمنظفات الصناعية والميكانيكية وناقص التوتر تعطل وخلية تحلل الخيارات، التي يمكن أن تستخدم لعزل نواة.
Abstract
سبر التعبير الجيني خلية واحدة يمكن التعرف على نوع الخلية والخلية الدولة. وقد ظهرت تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة كأداة قوية لدراسة الملامح النسخي للخلايا، ولا سيما في الأنسجة غير المتجانسة مثل الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك، تفكك الأساليب المطلوبة لتسلسل وحيد الخلية يمكن أن يؤدي إلى تغييرات تجريبية في وفاة خلية والتعبير الجيني. وعلاوة على ذلك، هذه الأساليب تقتصر عموما على أنسجة جديدة، مما يحد من دراسات بشأن المحفوظات والمواد البيولوجية-البنك. تسلسل واحد نواة الجيش الملكي النيبالي (سنرنا-Seq) هو بديل جذاب للدراسات النسخي، نظراً لأنه يحدد أنواع الخلايا بدقة، ويسمح بدراسة الأنسجة المجمدة أو يصعب فصل، ويقلل من فعل الانفصال النسخ. نقدم هنا، بروتوكول الفائق لعزل السريع من الأنوية للمتلقين للمعلومات سنرنا–ما يليها هذا الأسلوب يتيح عزل نواة من عينات النخاع الشوكي الطازجة أو المجمدة، ويمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع اثنين من منصات تغليف الحبرية موازية على نطاق واسع.
Introduction
الجهاز العصبي يتكون من مجموعات مستمدة من الخلايا التي تعرض مجموعة متنوعة من الخصائص المورفولوجية والبيوكيميائية والكهربية. أثناء تسلسل الحمض النووي الريبي السائبة كانت مفيدة لتحديد التغيرات على صعيد الأنسجة في التعبير الجيني في ظروف مختلفة، فإنه يحول دون الكشف عن التغييرات النسخي على مستوى خلية واحدة. التقدم الذي أحرز مؤخرا في تحليل النسخي خلية واحدة قد مكنت تصنيف الخلايا ايربان إلى المجموعات الوظيفية استناداً إلى ذخيرتهم الجزيئية ويمكن حتى أن تكون الاستدانة للكشف عن مجموعات من الخلايا العصبية التي نشطت مؤخرا. 1 , 2 , 3 , 4 على مدى السنوات العشر الماضية، قد مكن تطوير الجيش الملكي النيبالي خلية مفردة التسلسل (سكرنا-Seq) دراسة التعبير الجيني في الخلايا الفردية، وتقديم وجهة نظر إلى تنوع من نوع الخلية. 5
وقدمت ظهور نهج قابلة للتطوير مثل سرنا موازية على نطاق واسع-Seq، منصات لتسلسل أنسجة غير متجانسة، بما في ذلك مناطق عديدة في الجهاز العصبي المركزي. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 ومع ذلك، أساليب تفكك خلية مفردة يمكن أن يؤدي إلى موت الخلية، فضلا عن التغييرات التجريبية في التعبير الجيني. 16 العمل مؤخرا بتكييف أساليب تسلسل خلية واحدة لتمكين المحافظة على الملامح النسخي الذاتية. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 وكانت هذه الاستراتيجيات ملائمة بصفة خاصة للكشف عن التعبير الجيني (IEG) المبكر الفوري عقب التحفيز الحسي أو السلوك. 3 , 4 في المستقبل، هذه الاستراتيجية أيضا يمكن لدراسة التغيرات الدينامية في الأنسجة في الحالات المرضية أو استجابة للتأكيد. من هذه الأساليب، هو تسلسل واحد نواة الجيش الملكي النيبالي (سنرنا-Seq) نهج واعدة التي لا تنطوي على الإجهاد يحفز تفكك الخلية ويمكن استخدامها على صعوبة أن تنأى بالانسجة (مثل الحبل الشوكي)، فضلا عن تجميد الأنسجة. 4 , 17 , 18 , 19 مواءمة من أساليب العزلة نويات السابقة،20،،من2122،،من2325 سنرنا Seq عادة يستخدم التقويض السريع الأنسجة والخلية تحلل تحت الظروف الباردة والطرد المركزي، وفصل النوى عن الحطام الخلوية. 4 نواة يمكن أن تكون معزولة لتسلسل الجيل المتلقين للمعلومات على منصات متعددة في تغليف الحبرية موائع جزيئية. 4 , 7 , 24 , 25 يسمح هذا الأسلوب للقطة من النشاط الترانسكربتي الآلاف من الخلايا في لحظة من الزمن.
وهناك استراتيجيات متعددة للإفراج عن نواة من الخلايا قبل عزلة والتسلسل، كل منها بمزاياها وعيوبها. هنا، يمكننا وصف ومقارنة البروتوكولين الملحقين بتمكين عزل نواة من الحبل الشوكي الكبار لكثافة موازية المتلقين للمعلومات سنرنا-Seq: تحلل المنظفات الصناعية والميكانيكية وتحلل ناقص التوتر والميكانيكية. ويوفر تحلل المنظفات الصناعية والميكانيكية اختلال الأنسجة كاملة وارتفاع عائد نهائي من الأنوية. ناقص التوتر الميكانيكية-تحلل يتضمن درجة السيطرة عليها من اختلال الأنسجة، مما أتاح فرصة لتحديد توازن بين الكمية ونقاء الغلة النووي نهائياً. وتوفر هذه النهج مقارنة الحمض النووي الريبي الغلة، أرقام تم اكتشاف الجينات كل نواة، والتنميط نوع الخلية وأيضا على حد سواء استخدامها بنجاح لما يليها سنرنا
Protocol
Representative Results
Discussion
والهدف النهائي لهذا البروتوكول عزل الأنوية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي عالية الجودة لتحليل النسخي المتلقين للمعلومات. علينا تكييف أساليب Seq سنرنا أجل الشخصية كافة أنواع الخلايا في الحبل الشوكي. وفي البداية، وجدنا أن الخلية النموذجية الانفصال من أساليب غير فعالة لتسلسل وحيد الخلي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها برنامج NINDS داخلية (1 ضياء NS003153 02) و NIDCD (1 ضياء DC000059 18). ونحن نشكر لي ل. و C.I. دوبروت للدعم الفني ومناقشات مفيدة، وكاثي جيم لاستعراض المخطوطة.
Materials
| Sucrose | Invitrogen | 15503-022 | |
| 1 M HEPES (pH = 8.0) | Gibco | 15630-080 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| MgAc | Sigma Aldrich | M1028-10X1ML | |
| 0.5 M EDTA (pH = 8.0) | Corning | MT-46034CI | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 10197777001 | Add DTT just prior to use |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Nuclease-free water | Crystalgen | 221-238-10 | |
| 1 M Tris-HCl (pH = 7.4) | Sigma Aldrich | T2194 | |
| 5 M NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| 1 M MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Nonidet P40 | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| B27 (50X) | Gibco | 17504-044 | |
| 1X PBS | Crystalgen | 221-133-10 | |
| 0.04% BSA | New England Biolabs | B9000S | |
| 0.2 U/μL RNAse Inhibitor | Lucigen | 30281-1 | |
| Oak Ridge Centrifuge Tube | Thermo Scientific | 3118-0050 | |
| Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| Glass Tissue Dounce (2 ml) | Kimble | 885303-002 | |
| Glass large clearance pestle | Kimble | 885301-0002 | |
| Glass small clearance pestle | Kimble | 885302-002 | |
| T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer | IKA | 3737001 | |
| Dispersing tool (S 10 N – 5G) | IKA | 3304000 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| MACS SmartStrainers, 30 μm | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Conical tubes | Denville Scientific | 1000799 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004505 | |
| Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor | Thermo Fisher Scientific | 75003698 | |
| Sterological Pipettes: 5 ml, 10 ml | Denville Scientific | P7127 | |
| Hemocytometer | Daigger Scientific | EF16034F | |
| Chemgenes Barcoding Beads | Chemgenes | Macosko-2011-10 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm) | Corning | 352235 | |
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10X Genomics | 120262 | |
| Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns | 10X Genomics | 120267 | |
| Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns | 10X Genomics | ||
| Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) | Corning | 353002 |
References
- Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).
- Hu, P., et al. Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq. Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).
- Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
- Sathyamurthy, A., et al. Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior. Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).
- Campbell, J. N., et al. A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types. Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity. Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967 (2016).
- Shin, J., et al. Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
- Villani, A. C., et al. Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors. Science. 356 (6335), (2017).
- Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
- Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7, 11022 (2016).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).
- Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
- Halder, R., et al. DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory. Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- . Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing (2018)
- 10X Genomics. . Single Cell 3′ Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).
- Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord. Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).
- Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).
- Bakken, T. E. Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing. bioRxiv. , (2018).
- Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
