Overvågning Hippo signalering Pathway aktivitet ved hjælp af en Luciferase-baserede store Tumor Suppressor (LATS) Biosensor

Summary

Her præsenterer vi en luciferase-baserede biosensor for at kvantificere kinase aktiviteten af stor tumor suppressor (LATS)-en central kinase i Hippo signalering pathway. Denne biosensor har forskellige programmer i basic og Translationel forskning med henblik på at undersøge Hippo pathway lovgivere i in vitro og i vivo.

Abstract

Hippo signalering pathway er en bevaret regulator af orgel størrelse og har vigtige roller i udvikling og kræft biologi. På grund af tekniske udfordringer, er det stadig vanskeligt at vurdere aktiviteten af denne signalvejen og fortolke det i en biologisk sammenhæng. Den eksisterende litteratur om store tumor suppressor (LATS) bygger på metoder, der kvalitativt og ikke kan nemt blive skaleret op til screening. For nylig, har vi udviklet en bioluminescens-baserede biosensor for at overvåge kinase aktiviteten af LATS-en kernekomponent i Hippo kinase cascade. Her, beskrive vi procedurer for hvordan denne LATS biosensor (LATS-BS) kan bruges til at karakterisere Hippo pathway regulatorer. Først, vi leverer en detaljeret protokol for at undersøge effekten af en overexpressed protein kandidat (f.eks.VEGFR2) på LATS aktivitet ved hjælp af LATS-BS. Derefter, vi viser, hvordan LATS-BS kan bruges til en mindre kinase inhibitor skærm. Denne protokol kan realistisk være skaleres op til at udføre større skærme, som uden tvivl vil identificere roman regulatorer af Hippo pathway.

Introduction

Hippo signalering pathway blev først identificeret i Drosophila som en roman regulator af cellevækst og dyrenes størrelse^1,2. Siden sin første opdagelse, montering beviser har overbevisende vist at Hippo pathway spiller afgørende roller i udviklingen (f.eks., tidlige fosterudviklingen, organ størrelse kontrol, og tre-dimensionelle [3D] morfologi) () tumordannelse fx, tumor udvikling, metastase, angiogenese, immun unddragelse, genomisk ustabilitet, stressrespons og resistens), og væv homeostase (fx, stamcelle fornyelse og differentiering og vævsregeneration efter skade) ^{3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10}. hippo signalering er ofte dysregulated i forskellige kræftformer^{7,8,9,10,11,12}. Derfor er belyse funktioner af Hippo pathway i kræft biologi og therapeutics og regenerativ medicin blevet et af de hotteste områder i biomedicinsk forskning.

I korte, i Hippo pathway ved aktivering af upstream tilsynsmyndigheder (f.eks.celle-celle kontakt, næringsstof stress og ekstracellulære matrix [ECM]), MST1/2 (MST; pattedyr homologs i Drosophila Hippo) Serin/Threonin (S/T) kinaser phosphorylate/aktivere adapteren proteiner hMOB1 og WW45, samt LATS1/2 (LATS) kinaser, som efterfølgende phosphorylate transcriptional Co aktivator YAP og dens paralog TAZ på bevarede HX(H/R/K)XX(S/T) (H, histidin; Rasmussen, arginin; K, lysin; Sørensen, Serin; T, threonin; X, alle aminosyrer) motiver, herunder YAP-S127 og TAZ-S89^11,12. S127-fosforyleret YAP (YAP-pS127) og S89-fosforyleret TAZ (TAZ-pS89) er nedbrudt af ubiquitination eller binde til cytoplasmatiske protein 14-3-3 og er forhindret i at interagere med TEAD1-4 transskriptionsfaktorer i cellekernen til transactivate nedstrøms gener involveret i celleproliferation og apoptose (figur 1). Trods den enorme interesse i Hippo pathway, få værktøjer til måling af Hippo signalering findes og dem, der have været historisk begrænset til indberettere af YAP/TAZ/TEAD transcriptional output. Ja, indtil for nylig var der ingen værktøjer til at måle dynamikken og aktivitet af Hippo signalering komponenter i en kvantitativ, real-time, høj overførselshastighed og non-invasiv måde både in vitro- og in vivo.

I betragtning af vores nye forståelse af protein-protein interaktioner i fysiologi og patologi rolle, er der stor interesse i udviklingen af værktøjer, der kan bruges til at studere disse interaktioner i en kvantitativ og real-time måde^{13, 14,15,16}. Faktisk er der sket betydelige fremskridt i udviklingen af bio-analytiske strategier, herunder gær to-hybrid (Y2H)¹⁷, overflade plasmon resonans (SPR)¹⁸og Förster resonans energi overførsel (FRET)¹⁹ assays, at evaluere protein-protein interaktioner. Men disse tilgange bære begrænsning af kræver betydelig optimering af reporter orientering, således at mange konstruktioner skal afprøves for at finde en effektiv. Yderligere, disse tilgange også har et relativt lavt signal / støj-forhold, så kræsne et sandt positive signaler kan være udfordrende.

Protein komplementering assays blev udviklet for at overvinde disse begrænsninger. Den første generation af protein komplementering assays blev baseret på split multicolor fluorescens proteiner og kunne ikke løse ovennævnte begrænsninger²⁰. Flerfarvet fluorescens proteiner består af kun ét domæne, hvilket gør det vanskeligt at opdele dem i to separate stabil fragmenter med lav affinitet og baggrund støj²¹. Efterfølgende, blev firefly luciferase identificeret som en ny kandidat til brug i udviklingen af split protein komplementering assays. I denne tilgang, er firefly luciferase opdelt i to fragmenter (N-terminal og C-terminale luciferase [NLuc og CLuc]) med hver fragment smeltet til en target protein af interesse. Hvis NLuc og CLuc er bragt i nærhed af samspillet mellem to mål proteinerne, luciferase aktivitet er rekonstitueret og en bioluminescerende light er genereres luciferin substrat og ATP²². I 2001, ved at udføre en kombinatorisk screening ved hjælp af et bibliotek som indeholder NLuc og CLuc fragmenter skåret på forskellige steder og fastgjort til proteiner med forskellige linkers, Paulmurugan og Gambhir på Stanford Universitet udviklet en optimeret split-firefly luciferase fragment-assisteret komplementering system for protein-protein interaktioner²³. I dette system, er firefly luciferase bagfjerding aminosyre (aa) 398 danner NLuc og CLuc, som er knyttet til to proteiner af interesse ved hjælp af en fleksibel linker otte glycin restkoncentrationer og to Serin restkoncentrationer.

Ved hjælp af en lignende tilgang, vi for nylig udviklet en ny LATS-BS ved at fusionere NLuc til 15 aa af YAP omkring LATS fosforylering websted på S127 (YAP15) og CLuc med 14-3-3. Fuld længde YAP protein var ikke anvendes, at undgå forstyrrende signaler af posttranslationelle modifikationer af YAP (fx, fosforylering på andre sites og ubiquitination) af andre opstrøms regulatorer. LATS-BS præsenteres her kan ikke-invasivt overvåge Hippo signalering aktivitet, både in vitro i levende celler og vivo på mus^20,24 (figur 2). Her beskriver vi en detaljeret protokol til måling af LATS kinase aktivitet in vitro- brug LATS-BS. Vi viser først, hvordan LATS-BS kan bruges til at undersøge effekten af en overexpressed protein på LATS aktivitet. Derefter, vi viser, hvordan biosensor kan bruges til at overvåge aktiviteten på Hippo pathway efter behandling med agenter regulering Hippo pathway. Denne protokol kan bruges til at identificere og karakterisere signaling veje eller stimuli regulering LATS kinase aktivitet.

Protocol

1. undersøgelse af et formodet Regulator af Hippo signalering, ved hjælp af LATS-BS Plating og Transfektion af celler Forberedelse af cellekultur Varm 1 x PBS, DMEM som indeholder 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin og 0,25% trypsin-EDTA til 37 ° C i vandbad i ca 30 min. Grundigt rense en biosikkerhed kabinet med 70% ethanol. Placere vævskultur retter, Pasteur pipetter, serologisk pipetter og pipette tips i vævskultur hood som krævet. <…

Representative Results

LATS-BS var cotransfected med forskellige gener til at vurdere deres effekt på LATS aktivitet (figur 3). I dette eksperiment, blev Renilla brugt som en intern kontrol. Den forbigående udtryk af YAP-5SA, en konstitutiv aktiv form af YAP, forårsager stigende niveauer af YAP transcriptional mål og en efterfølgende stigning i LATS kinase aktivitet gennem en etableret feedback pathway25. MST, opstrøms aktivator af LATS i Hipp…

Discussion

Mens Hippo pathway spiller vigtige roller i forskellige biologiske processer og dysregulering af Hippo sti fører til kræft⁶, er hvordan Hippo pathway er reguleret i respons på forskellige stimuli ikke helt forstået. Derudover er der ingen kvantitative og real-time system til at vurdere aktiviteten af Hippo kernekomponenter. For nylig har vi udviklet og valideret en roman biosensor til måling af LATS kinase aktivitet i Hippo pathway²⁴. Denne biosensor kan bruges ikke bl…

Materials

Trypsin-EDTA	Life Technologies	2520056	0.25%
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F1051
DMEM	Sigma	D6429-500ml	DMEM with high glucose
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122
PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent	Signagen	SL100688.5
5x Passive lysis buffer	Promega	E194A	30 ml
Dual-Glo® Luciferase Assay System	Promega	E2940	100 ml kit
20/20 luminometer	Turner Biosystems	998-2036	Single tube reader luminometer
GloMax®Navigator with dual injectors	Promega	GM2010	96-well plates reader luminometer