유도할 수 있는 고 가역 지배-네거티브 (DN) 단백질 억제
Summary
여기 선물이 있는 어떤 단백질 수 수 조건부로 비활성화 역 그것의 지배적인 부정적인 돌연변이 버전 overexpressing에 의해 지배 부정적인 유도할 수 있는 시스템을 개발 하는 프로토콜.
Abstract
지배적인 네거티브 (DN) 단백질 억제 단백질 기능을 조작 하는 강력한 방법 이며, 다른 게놈 기반 접근을 통해 여러 가지 이점을 제공 합니다. 예를 들어 비록 공상 Cre LoxP 타겟팅 전략을 널리 사용 되어 왔습니다, (즉, 새 발기인 활동, 모자이크 Cre 식, 등) 이러한 전략의 본질적인 한계 크게 제한 하 고 그들의 응용 프로그램입니다. 또한, 많은 내 생 유전자의 완전 한 삭제는 embryonically, 출생 후 생활에 유전자 기능을 연구 하는 게 불가능 한 만드는 치명적인입니다. 이러한 과제를 해결 하기 위해 우리는 초기 유전 공학 프로토콜 중요 한 변경 있고 Rb1 유전자의 짧은 (유전자 변형) 버전 lysosomal 효소와 결합 하 여 procathepsin B (CB), Rb1의 DN 마우스 모델 생성 (CBRb). Lysosomal 효소의 존재로 인해 전체 CB RB1 융합 단백질 및 그 상호 작용 복잡 한 프로테아좀 중재 저하에 라우팅됩니다. 또한, 유전자 변형 구문에서 항생물질 유도 (rtTA) 요소 있으면 RB1 단백질의 유도할 수 있는 고 가역 규칙을 수 있습니다. CBRb 마우스 모델에서 유비 쿼터 스로 사 CAG 발기인의 존재 하기가 일시적이 고 가역 Rb1 유전자 제거 수행 하 고 거의 모든 세포 유형에 있는 그것의 활동을 이해 하기 위한 연구는 리소스를 제공 하는 유용한 도구 RB1 표현 된다.
Introduction
일반적으로 완전 한 제거 또는 유전자, RNA 시퀀스, 또는 관심사 (POI)의 단백질의 자르기 이어질 영구 프로세스에 의존 하는 유전자 및 단백질 제거를 목표로 대부분 접근. 이 방법의 전반적인 목표는 내 생, 야생-타입 단백질의 기능을 폐지 하 고 재조합 단백질 하입니다. 우리가 재검토 하 고 개편 한 대체 전략1,2, DN 억제를 통해 POI의 임시 제거를 허용. 이 방법은 multimeric와 단위체 펩 티 드에 대 한 작동 하지만 단백질 multimeric 어셈블리에 기능을 위해 가장 적합 한.
메서드를 융합 하는 lysosomal 효소 CB multimeric POI (CB 퓨전 복잡 한)의 소 단위를 이루어져 있다. 복잡 한 결과 CB 퓨전 수 상호 작용 및 proteolytically 생 단백질 소화 또는 전체 CB POI 복잡 한 수 저하3리소좀을 전환. 또한, 유도할 수 있는 자연 항생물질 제어 transcriptional 활성화 (TetO) 시스템의 복잡 한 CB 융해의 함께 가역 패션2transgene의 제어 하 고 유도할 수 있는 표현에 대 한 수 있습니다. 많은 경우에 유용 하지만 치4,,56유전자 또는 vivo에서 단백질의 완전 한 삭제 될 수 있습니다. 궁극적으로, 중요 한 게놈 요소7의 영구 손실 이어질 것입니다, 마찬가지로, 일부 유전자 또는 단백질 Cre/Lox 체계를 사용 하 여 조직 관련, 조건부 삭제 간단 되지 않을 수 있습니다. 따라서, 유전자 또는 POI에 따라 이러한 접근의 후속 연구에 대 한 유용한 모델을 제공 효과가 있을 것입니다 특히 유전자 또는 단백질의 기능 연구 늦은 출생 후와 성인 쥐에.
이러한 접근법과 관련 된 문제를 회피 하 고 제공 증거의 원칙에 제안된 된 방법의 효과 선택 했습니다 Retinoblastoma 1 (RB1) 단백질의 조건부 DN 버전을 생성 하 여 여기에 제시 된 메서드를 테스트 하려면. 몇 가지 옵션이 제안된8,,910 생 RB1;의 기능을 폐지 하 고 있다 그러나, 그들의 모두 위에서 설명한 동일한 제한 사항 중 일부에 직면: RB1의 영구적인 생식 삭제 embryonically 치명적인 이며, 종양11의 다양 한 종양 억제기 역할, 영구 RB1 조건부 삭제 리드. RB1의 DN 버전 자연스럽 게 발생 하지 않는, 비록 현재 사용할 수 있는 전략에 대 한 더 나은 대안 생 RB1의 일시적으로 제어 비활성화에 대 한 허용 해야 하 고 결국 복원 하는 대체 메커니즘을 제공의 기능입니다. 이러한 구문으로 2 년간 전 설명 했다1. 그러나, 기술적 제한으로 인해 그것은 메커니즘 제어 transgene 활성화, 응답, 및 조직 특이성을 부족. 이 연구는 먼저 doxycycline (Dox)의 우아함과 결합-lysosomal 효소 CB 및 Rb1 단백질의 조작된 유전자 변형 구문으로 종속 transcriptional 시스템. 결과 CBRb 마우스 모델 일시적으로 규제 Dox 중재 RB1 허용 규정2. 이러한 프로테옴 기반 접근을 사용 하 여 유전자 기능을 연구 하의 장점은 어떤 유전자의, 그것의 활동에 대 한 최소한의 정보에 대 한 채택 될 수 있다.
제안 된 DN transgene 전략 전통적인 접근에 많은 이점이 있습니다. 첫째, DN 단백질 억제 단백질 활동, 따라서 잔여 생 식 보존에 부분 절제를 리드. 이러한 결과 단백질 활동의 완전 한 제거 라이브 마우스에서 유전자 기능 연구에 어떤 조사를 크게 제한 하는 배아 치 사 율을 리드 하는 상황에서 매우 바람직합니다. 둘째, TetO 시스템의 존재는 transgene 활동의 효율적이 고 가역 제어할 수 있는 항생제, 존재만 transgene 활성화를 수 있습니다. 따라서, 항생제 관리를 중단 하 여 유전자 변형 시스템을 비활성화할 수 있습니다, 하 고는 정상적인 RB1 식이 다시 자리에에서 키를 누릅니다. 셋째, transgene 식의 특이성의 선택의 발기인에 따라 달라질 수 있습니다. 우리는 증거의 원칙에 대 한 유비 쿼터 스로 사 CAG 발기인 선택, 조직 관련 발기인 아래 transgene 삽입 가능성이 높습니다 원치 않는 transgene 식 제한이 transgene의 치료 응용 프로그램에 대 한 연구를 촉진 하 입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우회 전통적인 유전자 변형 전략와 관련 된 한계, 우리는 내 생 포 수 수 조건부로 비활성화 spatiotemporal 방식에서 그것의 DN 돌연변이 형태를 overexpressing에 의해 마우스 모델을 생성 하고자 했다. 내 생 Poi의 기능을 폐지 하 고 몇 가지 옵션이 제안된15,,1617되었습니다. 우리 그 식의 표현에 영향을 미치는 돌연변이 펩 티 드를 생?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PCS2 + CB Myc6 벡터 마샬 츠 (워싱턴 대학교, 시애틀, 워싱턴, 미국)에서 선물 했다. 헤이-OC1 셀 Fedrico Kalinec (데이비드 게 펜의과 대학, UCLA, 로스 앤젤레스, 캘리포니아, 미국)에 의해 친절 하 게 제공 되었다. 기술 지원 UNMC 마우스 게놈 엔지니어링 핵심 (cb를 Gurumurthy, 돈 Harms, 롤 렌 Quadros) 그리고 Creighton 대학 통합 생물 의학 이미징 시설 (리처드 Hallworth, 존 Billheimer)에 의해 제공 되었다. P20 GM103471 번호 부여 UNMC 마우스 게놈 엔지니어링/NIGMS, NIH에서에서 기관 개발 수상 (IDea는)에 의해 지원 되었다. 통합 생물 의학 이미징 시설 의학 및 GM103427 및 GM110768는 NIH/NIGMS에서 보조금 크레이 톤 대학에 의해 지원 되었다. 시설 연구 자원 (RR016469)에 대 한 국립 센터에서 교부 금 지원으로 건립 되었다 고 NIGMS (GM103427). 이 연구에서 생성 된 마우스 라인 크레이 톤 대학교 동물 자원 시설, 누구의 인프라 NIH/NCRR G20RR024001에 의해 부여를 통해 개량 되었다 유지 되었다. 과거는 NIH/NCRR 5P20RR018788-/ NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE 부여 (셸리 D. 스미스), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S. S.M.R.), 그리고는 신흥 연구 부여 심리 건강 재단에서 (S. Tarang)를 통해 지원 받은이 작품. 이 연구의 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferation kit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 antibody | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antibody | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Phallodin | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescence microplate reader | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescence microscope | NikonEclipse80i | ||
| The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. |
References
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