تثبيط البروتين إيندوسيبلي وعكسها المهيمنة سالب (DN)
Summary
نقدم هنا بروتوكولا لتطوير نظام إيندوسيبلي السلبية السائدة، التي أي بروتين يمكن يكون إفراجاً مشروطاً معطل عكسية overexpressing نسخة متحولة السلبية المهيمنة.
Abstract
تثبيط البروتين (DN) سالب المهيمن هو وسيلة قوية التعامل مع وظيفة البروتين ويوفر مزايا عديدة أكثر من غيرها من النهج القائم على الجينوم. على سبيل المثال، على الرغم من أن تشيميريك و لوكسب Cre استراتيجيات الاستهداف وقد استخدمت على نطاق واسع، القيود المتأصلة من هذه الاستراتيجيات (أي نشاط المروج راشح، فسيفساء Cre التعبير، إلخ) قيدت إلى حد كبير على التطبيق. وعلاوة على ذلك، حذف كامل للعديد من الجينات الذاتية شأن الفتاكة، مما يجعل من المستحيل على دراسة وظيفة الجينات في الحياة بعد الولادة. ولمعالجة هذه التحديات، تغييرات كبيرة في وضع بروتوكول هندسة الوراثية مبكرة ومقترنا حوزتي الليزوزومية نسخة (المعدلة وراثيا) قصيرة من الجينات Rb1 بروكاثيبسين ب (CB)، لإنشاء نموذج ماوس DN من Rb1 (كبرب). بسبب وجود حوزتي الليزوزومية، يتم توجيه البروتين الانصهار CB-RB1 كامل وبه مجمع المتفاعلة للتدهور بوساطة بروتوزوم. وعلاوة على ذلك، يتيح وجود عنصر محفز (رتا) التتراسيكلين في البناء المعدلة وراثيا لائحة إيندوسيبلي وعكسها للبروتين RB1. وجود مروج روزا-المساعدة النقدية في كل مكان في طراز الماوس كبرب يجعلها أداة مفيدة القيام بالاستئصال الجيني Rb1 عابرة وعكسها وتزويد الباحثين موارد لفهم نشاطها في تقريبا أي نوع من الخلايا حيث يتم التعبير عن RB1.
Introduction
معظم النهج الرامية إلى أبلاتيونس الجينات والبروتين تعتمد على العمليات الدائمة، التي تؤدي عموما إلى القضاء التام على أو اقتطاع الجينات، وتسلسل الحمض النووي الريبي أو البروتين من الاهتمام (POI). والهدف العام لهذا الأسلوب مهندس بروتين المؤتلف بإلغاء وظيفة البروتين الذاتية، والبرية من نوع. قمنا بإعادة النظر وتجديده استراتيجية بديلة1،2، والذي يسمح للاجتثاث المؤقتة البوي عن طريق تثبيط DN. هذا الأسلوب يعمل لكل من مولتيميريك والببتيدات أحادي ولكن هو الأنسب للبروتينات التي تعمل في جمعية مولتيميريك.
الأسلوب الذي يتكون من الصمامات حوزتي الليزوزومية CB لوحدة فرعية من مولتيميريك البوي (CB الانصهار المعقدة). الانصهار CB الناتجة معقدة يمكن أن تتفاعل مع وبروتيوليتيكالي هضم البروتين الذاتية أو تحويل المجمع بأكمله البوي CB إلى يحلول أن يكون المتدهورة3. وعلاوة على ذلك، مزيج من الانصهار CB المعقدة مع الطابع إيندوسيبلي لنظام التنشيط النسخي تسيطر عليها التتراسيكلين (تيتو) يسمح لتعبير إيندوسيبلي والتي تسيطر عليها من التحوير في أزياء عكسها2. على الرغم من أن مفيد في العديد من الحالات، يمكن أن يؤدي الحذف الكامل للجينات أو البروتينات المجراة في الفتك4،،من56. وبالمثل، الحذف الخاصة بالانسجة، والشرطي لبعض الجينات أو البروتينات باستخدام نظام لوكس Cre/قد لا تكون واضحة، كما أنه، في نهاية المطاف، سيؤدي إلى خسارة دائمة للعناصر الجينية الحاسمة7. ولذلك، اعتماداً على الجينات أو البوي، أيا من هذه النهج سيكون من فعالية في تقدم نموذجا مفيداً للدراسات اللاحقة، لا سيما الجينات أو البروتينات الدراسات الفنية في الفئران بعد الولادة والكبار أواخر.
للالتفاف على المشاكل المرتبطة بهذه النهج وتقديم إثبات لمبدأ فعالية الطريقة المقترحة، اخترنا لاختبار الأسلوب الذي قدمه هنا توليد نسخة DN شرطي من البروتين الشبكية 1 (RB1). وكانت العديد من الخيارات المقترحة8،،من910 إلى إلغاء وظيفة RB1 الذاتية؛ لكن كل منهم تواجه بعض القيود نفسها المذكورة أعلاه: حذف الخط الدائم RB1 شأن الفتاكة، والحذف الشرطي RB1 تمشيا مع دورها القامع الورم، دائم يؤدي إلى مجموعة متنوعة من الأورام11. على الرغم من أن إصدار DN من RB1 لا يبدو أن يحدث بطبيعة الحال، أفضل بديل للاستراتيجيات المتاحة حاليا ينبغي أن تسمح المنظمة التي تسيطر عليها وقتيا من RB1 الذاتية وتوفير إليه بديلة في نهاية المطاف إعادة لها الدالة. ووصفت أساسا لتركيبة من هذا القبيل منذ أكثر من عقدين من الزمان1. ومع ذلك، بسبب القيود التكنولوجية، أنها تفتقر إلى إليه لمراقبة التحوير التنشيط واستجابة، وخصوصية النسيج. وهذه الدراسة هي الأول من الجمع بين أناقة الدوكسي (دوكس)-يعتمد النظام النسخي مع مقولة أساسية المعدلة وراثيا هندسيا من بروتينات سي بي و Rb1 البروتياز الليزوزومية. نموذج كبرب الناتجة على الماوس يسمح RB1 دوكس بوساطة مؤقتاً ينظم البند2. وميزة استخدام هذا نهج القائم على البروتين لدراسة وظيفة الجينات أن يتم اعتماده للجينات أي اهتمام، مع الحد الأدنى من المعلومات عن نشاطه.
الاستراتيجية المقترحة للتحوير DN يوفر مزايا عديدة أكثر من النهج التقليدي. أولاً، يؤدي تثبيط البروتين DN إلى إلا الاستئصال الجزئي في نشاط البروتين، وبالتالي الحفاظ على تعبير ذاتية متبقية. هذه نتيجة مرغوب فيه للغاية في الحالات التي يؤدي فيها القضاء تام على نشاط البروتين إلى الفتك الجنينية، تحد إلى حد كبير أي تحقيق لدراسة وظيفة الجينات في ماوس حية. ثانيا، وجود نظام تيتو تمكين التنشيط التحوير إلا بوجود المضادات الحيوية، مما يسمح لعنصر الكفاءة و عكسها على نشاط التحوير. وهكذا، بالتوقف الصادات، يمكن إلغاء تنشيط النظام المحورة وراثيا، وتعبير RB1 عادي مرة أخرى في المكان. ثالثا، يمكن أن تختلف خصوصية التعبير التحوير اعتماداً على المروج للاختيار. في حين أننا اخترنا المروج روزا-المساعدة النقدية في كل مكان للإثبات للمبدأ، وضع التحوير تحت مروج الأنسجة على حدة من المرجح أن تقييد التعبير التحوير غير المرغوب فيها وتسهيل الدراسات المتعلقة بتطبيق هذا التحوير العلاجية منهجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
للتحايل على القيود المرتبطة بالاستراتيجيات التقليدية المعدلة وراثيا، سعينا إلى إنشاء نموذج ماوس التي البوي ذاتية يمكن تكون إفراجاً مشروطاً معطل قبل overexpressing نموذج DN المسخ منه بطريقة الزمانية المكانية. إلغاء الوظيفة من النقاط المهمة الذاتية، كان العديد من الخيارات المقترحة15</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PCS2 + سي بي-Myc6 ناقل كان هدية من هورويتز مارشال (جامعة واشنطن، سياتل، واشنطن، الولايات المتحدة الأمريكية). وقدمت الخلايا هيي-OC1 يرجى فيدريكو كالينيك (ديفيد جيفن كلية الطب، جامعة كاليفورنيا، لوس أنجلس، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). قدم الدعم التقني نبراسكا الماوس الجينوم الهندسية الأساسية (C.B. غورومورثي، دون أضرار، ذلك رولين) وكريتون جامعة متكاملة الطبية التصوير مرفق (هالوورث ريتشارد، جون بليمير). هندسة الجينوم الماوس في نبراسكا أيده “جائزة التنمية المؤسسية” (فكرة) من المعاهد الوطنية للصحة/نيجمس، منح رقم P20 GM103471. وأيد مدرسة جامعة كريتون الطب ومنح GM103427 و GM110768 من المعاهد الوطنية للصحة/نيجمس “مرفق التصوير الطبية المتكاملة”. المرفق شيد بدعم من المنح المقدمة من المركز الوطني “بحوث الموارد” (RR016469) ونيجمس (GM103427). وأبقى على خطوط الماوس التي تم إنشاؤها في هذه الدراسة في جامعة كريتون “مرفق الموارد الحيوانية”، البنية التحتية التي تحسنت بفضل منحة من المعاهد الوطنية للصحة/نكرر G20RR024001. هذا العمل تلقت في الماضي الدعم عن طريق المعاهد الوطنية للصحة/نكر 5P20RR018788-/المعاهد الوطنية للصحة/نيجمس 8P20GM103471 نحاس منح (شلي د. سميث)، والمعاهد الوطنية للصحة/عرب R21OD019745-01A1 (س-س)، وناشئة بحث منحة من “مؤسسة الصحة استماع” (ترانج س.). محتوى هذا البحث هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية “المعاهد الوطنية للصحة”.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferation kit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 antibody | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antibody | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Phallodin | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescence microplate reader | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescence microscope | NikonEclipse80i | ||
| The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. |
References
- Li, F. Q., et al. Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease. Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).
- Tarang, S., et al. Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model. Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).
- Kominami, E., et al. The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins. FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).
- Cortellino, S., et al. Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4. 발생학. 325 (1), 225-237 (2009).
- Ferreira, C., et al. Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).
- Lee, E. Y., et al. Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis. Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).
- Turlo, K. A., et al. When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss. 유전학. 186 (3), 959-967 (2010).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Zhang, J., et al. The first knockout mouse model of retinoblastoma. Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).
- Zhao, H., et al. Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).
- Yamasaki, L., et al. Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice. Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).
- Li, F. Q., et al. Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).
- Pitkanen, K., et al. Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation. Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).
- Chano, T., et al. Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation. International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).
- Kole, R., et al. RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).
- Yamamoto, A., et al. The ons and offs of inducible transgenic technology: A review. Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).
- Houdebine, L. M., et al. Transgenic animal models in biomedical research. Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).
- Brehm, A., et al. Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription. Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).
- Lu, Z., et al. E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer. Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).
- Magnaghi-Jaulin, L., et al. Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase. Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).
