Inducerbar og Reversible dominerende-negative (DN) Protein hæmning
Summary
Her præsenterer vi en protokol for at udvikle en dominerende negativ inducerbar system, som kan enhver protein betinget inaktiveret ved reversibelt overekspression en dominerende negativ mutant version af det.
Abstract
Dominerende-negative (DN) protein hæmning er en kraftfuld metode til at manipulere protein funktion og tilbyder flere fordele sammenlignet med andre genom-baserede tilgange. For eksempel, selv om kimære og Cre-LoxP rettet mod strategier har været udbredt, de iboende begrænsninger af disse strategier (dvs, utætte promotor aktivitet, mosaik Cre udtryk, etc.) har betydeligt begrænset deres ansøgning. En fuldstændig sletning af mange endogene gener er desuden embryonically dødbringende, hvilket gør det umuligt at studere genfunktion i postnatal liv. For at imødegå disse udfordringer, vi har foretaget væsentlige ændringer til en tidlig genteknologi protokol og kombineret et kort (transgene) version af Rb1 gen med et lysosomale protease procathepsin B (CB), til at generere en DN musemodel af Rb1 (CBRb). På grund af tilstedeværelsen af en lysosomale protease dirigeres hele CB-RB1 fusion protein og dens interagerende komplekse til proteasom-medieret nedbrydning. Derudover muliggør tilstedeværelsen af en tetracyklin inducer (rtTA) element i den transgene konstruere en inducerbar og reversibel regulering af RB1 protein. Tilstedeværelsen af en allestedsnærværende ROSA-CAG promotor i CBRb musen model gør det et nyttigt værktøj til at udføre vandrende og reversible Rb1 gen ablation og give forskere en ressource for at forstå sin aktivitet i stort set enhver celletype hvor RB1 udtrykkes.
Introduction
De fleste tilgange med sigte på gen- og protein ablations stole på permanent processer, som generelt fører til fuldstændig fjernelse eller trunkering af genet, RNA sekvenser eller protein af interesse (POI). Det overordnede mål med denne metode er at ingeniør en rekombinant protein for at ophæve funktionen af endogent, wild-type protein. Vi har fornyet og moderniseret en alternativ strategi1,2, som giver mulighed for den midlertidige ablation af en POI gennem DN hæmning. Denne metode virker for både multimeriske og monomere peptider men er bedst egnet til proteiner, der fungerer i en multimeriske forsamling.
Metoden består af sammensmeltning den lysosomale protease CB til en underenhed af en multimeriske POI (CB fusion komplekse). Den resulterende CB fusion komplekse kan interagere med og proteolytically fordøje den endogene protein eller aflede den hele CB-POI kompleks at lysosomet at være forringet3. Desuden, en kombination af CB fusion kompleks med inducerbar arten af tetracyclin-kontrollerede transcriptional (Millie) aktiveringssystem tillader for inducerbar og kontrolleret udtryk af transgenet i en reversibel mode2. Skønt nyttig i mange situationer, kan den fuldstændig sletning af gener eller proteiner in vivo resultere i dødelighed4,5,6. Væv-specifikke, betinget sletning af nogle gener eller proteiner ved hjælp af Cre/Lox system kan ligeledes ikke være ligetil, som det vil i sidste ende føre til permanent tab af kritiske genomisk elements7. Derfor, afhængigt af genet eller POI, ingen af disse tilgange vil være effektive i at yde en nyttig model for efterfølgende undersøgelser, især gener eller proteiner funktionelle studier i sen postnatal og voksen mus.
For at omgå de problemer i forbindelse med sådanne tilgange og give proof-of-principle på effektiviteten af den foreslåede metode, har vi valgt at teste metoden præsenteret her ved at generere en betinget DN version af Retinoblastom 1 (RB1) protein. Flere muligheder har været foreslået8,9,10 at afskaffe funktionen af endogent RB1; men alle af dem står over for nogle af de samme begrænsninger diskuteret ovenfor: permanent kønscelleoverførsel sletning af RB1 er embryonically dødbringende, og i overensstemmelse med dens tumor suppressor rolle, permanent RB1 betinget sletning fører til en bred vifte af tumorer11. Selvom en DN version af RB1 ikke synes at forekomme naturligt, et bedre alternativ til de aktuelt tilgængelige strategier bør give mulighed for et tidsligt styret Inaktiveringen af den endogene RB1 og give en alternativ mekanisme til sidst gendanne dens funktion. Grundlaget for sådan en konstruktion blev beskrevet mere end to årtier siden1. Men på grund af teknologiske begrænsninger, det manglede en mekanisme til kontrol transgen aktivering, svar og væv specificitet. Denne undersøgelse er først til at kombinere elegance af doxycyclin (Dox)-afhængige transcriptional system med en manipuleret transgene konstruktion af lysosomale protease CB og Rb1 proteiner. Den resulterende CBRb musen model giver mulighed for en midlertidigt regulerede Dox-medieret RB1 forordning2. Fordelen ved at bruge sådan en proteom-baseret tilgang til at studere genfunktion er, at det kan vedtages for enhver gen af interesse, med minimal information om sin aktivitet.
Den foreslåede DN transgen strategi tilbyder mange fordele i forhold til traditionelle metoder. Første, DN protein hæmning fører til kun en delvis ablation i protein aktivitet, dermed bevare en resterende endogene udtryk. Et sådant resultat er ønskeligt i situationer hvor en fuldstændig fjernelse af protein aktivitet fører til embryonale dødelighed, stærkt begrænse enhver undersøgelse for at studere genfunktion i en levende mus. Andet, tilstedeværelsen af Millie system muliggør transgen aktivisering kun ved tilstedeværelse af et antibiotikum, der muliggør en effektiv og reversible kontrol af transgenet aktivitet. Således, ved at ophøre med den antibiotikaet administration, transgene systemet kan deaktiveres, og en normal RB1 udtryk er tilbage på plads. For det tredje kan specificiteten af transgenet udtryk variere afhængigt af promotor af valg. Mens vi har valgt den allestedsnærværende ROSA-CAG promotor for proof-of-principle, er placere transgen et væv-specifikke promotor tilbøjelige til at begrænse uønskede transgen udtryk og lette undersøgelser om den terapeutiske anvendelse af denne transgen metodologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
For at omgå de begrænsninger, der er forbundet med traditionelle transgene strategier, forsøgte vi at generere en musemodel, hvor kan en endogen POI betinget inaktiveret ved overekspression en DN mutant form af det på en spatiotemporelle måde. For at ophæve funktionen af endogent POI’er, har flere muligheder været foreslået15,16,17. Vi har ændret en tidligere genetiske strategi1 ved at kombinere …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PCS2 + CB-Myc6 vektor var en gave fra Marshall Horwitz (University of Washington, Seattle, WA, USA). HEI-OC1 celler blev venligst leveret af Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA, USA). Teknisk støtte blev leveret fra den UNMC mus genom Engineering Core (C.B. Annis, Don Harms, Rolen Quadros) og Creighton University integreret biomedicinsk Imaging anlægget (Richard Hallworth, John Billheimer). UNMC musen genom Engineering blev støttet af en institutionel udvikling Award (idé) fra NIH/NIGMS, give nummer P20 GM103471. Den integrerede biomedicinsk Imaging facilitet blev støttet af Creighton University School of Medicine og grants GM103427 og GM110768 fra NIH/NIGMS. Anlægget blev bygget med støtte fra tilskud fra det nationale Center for forskningsressourcer (RR016469) og NIGMS (GM103427). Mus linjer oprettes i denne undersøgelse blev opretholdt på Creighton Universitys dyr ressource facilitet, hvis infrastrukturen er blevet forbedret gennem et tilskud af NIH/NCRR G20RR024001. Dette arbejde fik forbi støtte gennem en NIH/NCRR 5P20RR018788-/ NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE yde (til Shelley D. Smith), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S.M.R.-S.) og en spirende forskning tilskud fra Hearing Health Foundation (til S. Vagn). Indholdet af denne forskning er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferation kit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 antibody | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antibody | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Phallodin | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescence microplate reader | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescence microscope | NikonEclipse80i | ||
| The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. |
References
- Li, F. Q., et al. Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease. Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).
- Tarang, S., et al. Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model. Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).
- Kominami, E., et al. The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins. FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).
- Cortellino, S., et al. Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4. 발생학. 325 (1), 225-237 (2009).
- Ferreira, C., et al. Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).
- Lee, E. Y., et al. Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis. Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).
- Turlo, K. A., et al. When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss. 유전학. 186 (3), 959-967 (2010).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Zhang, J., et al. The first knockout mouse model of retinoblastoma. Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).
- Zhao, H., et al. Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).
- Yamasaki, L., et al. Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice. Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).
- Li, F. Q., et al. Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).
- Pitkanen, K., et al. Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation. Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).
- Chano, T., et al. Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation. International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).
- Kole, R., et al. RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).
- Yamamoto, A., et al. The ons and offs of inducible transgenic technology: A review. Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).
- Houdebine, L. M., et al. Transgenic animal models in biomedical research. Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).
- Brehm, A., et al. Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription. Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).
- Lu, Z., et al. E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer. Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).
- Magnaghi-Jaulin, L., et al. Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase. Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).
