Afleidbare en omkeerbare Dominant-negatief (DN) eiwit remming
Summary
Hier presenteren we een protocol voor de ontwikkeling van een dominant-negatieve afleidbare systeem, waarin elk eiwit kan voorwaardelijk worden geïnactiveerd door omkeerbaar overexpressing een dominant-negatieve mutant versie van het.
Abstract
Dominant-negatief (DN) eiwit inhibitie is een krachtige methode om te manipuleren eiwitfunctie en biedt diverse voordelen ten opzichte van andere genoom gebaseerde benaderingen. Bijvoorbeeld, hoewel chimeer en Cre-LoxP gerichte strategieën hebben op grote schaal gebruikt, de intrinsieke beperkingen van deze strategieën (dat wil zeggen, lekke promotor activiteit, mozaïek Cre expressie, enz.) zijn aanmerkelijk beperkt hun toepassing. Bovendien is een volledige schrapping van vele endogene genen embryonically dodelijk, waardoor het onmogelijk is om te studeren genfunctie in postnatale leven. Om deze uitdagingen, we hebben aanzienlijke wijzigingen aangebracht in een vroege gentechnologie-protocol en een korte (transgene) versie van het gen Rb1 gecombineerd met een lysosomale protease procathepsin B (CB), voor het genereren van een DN-muismodel van Rb1 (CBRb). Als gevolg van de aanwezigheid van een lysosomale protease, worden het gehele CB-RB1 fusieproteïne en haar interactie complex gerouteerd voor proteasoom-gemedieerde afbraak. Bovendien kan de aanwezigheid van een tetracycline inductor (rtTA)-element in de transgene constructie een afleidbare en omkeerbare regulering van de RB1 proteïne. De aanwezigheid van een alomtegenwoordige ROSA-CAG-promotor in de muismodel CBRb maakt het een nuttig instrument om te verrichten van voorbijgaande aard en omkeerbaar Rb1 gene ablatie en onderzoekers een resource voor het begrijpen van haar activiteiten in vrijwel elk celtype waar RB1 wordt uitgedrukt.
Introduction
Meeste benaderingen die gericht zijn op de gen- en eiwit ablations is afhankelijk van permanente processen, die over het algemeen tot de volledige uitbanning of afkappen van het gen, RNA opeenvolgingen of proteïne van belang (POI leiden). Het algemene doel van deze methode is om ingenieur een recombinant eiwit te schaffen van de functie van endogene, wild-type eiwit. Wij hebben revisited en vernieuwde een alternatieve strategie1,2, dat voorziet in de tijdelijke ablatie van een POI via DN remming. Deze methode werkt voor zowel multimeric als monomeer peptiden, maar is het meest geschikt voor de eiwitten die in een vergadering van de multimeric functioneren.
De methode bestaat uit het smelten van de lysosomale protease CB aan een subeenheid van een multimeric POI (CB smelting complexe). De resulterende CB fusie complexe kan communiceren met en proteolytically de endogene eiwit verteren of afleiden van het gehele complex van het CB-POI op het lysosoom als aangetaste3. Een combinatie van de complexe CB-fusie met de afleidbare aard van het tetracycline-gecontroleerde transcriptionele (TetO) activeringssysteem voorziet bovendien in een afleidbare en beheerste expressie van de transgenic in een omkeerbare mode2. Hoewel het nuttig in veel gevallen, kan de volledige schrapping van genen of eiwitten in vivo resulteren in letaliteit4,5,6. Ook weefsel-specifieke, voorwaardelijke schrapping van sommige genen of eiwitten met behulp van de Cre/Lox systeem mogelijk niet eenvoudig, zoals het uiteindelijk tot permanent verlies van kritieke genomic elements7 leiden zal. Daarom, afhankelijk van het gen of POI, zal geen van deze benaderingen zijn efficiënt in het verstrekken van een nuttig model voor latere studies, met name genen of eiwitten functionele studies in late postnatale en volwassen muizen.
Te omzeilen van de problemen in verband met een dergelijke aanpak en verstrekken bewijs-van-beginsel op de effectiviteit van de voorgestelde methode, die wij hebben gekozen voor het testen van de methode die hier wordt gepresenteerd door het genereren van een voorwaardelijke DN-versie van de proteïne Retinoblastoom 1 (RB1). Verschillende opties zijn voorgestelde8,9,10 tot afschaffing van de functie van endogene RB1; echter allemaal geconfronteerd enkele van dezelfde beperkingen hierboven besproken: permanente germline schrapping van RB1 is embryonically dodelijk en, conform haar tumor suppressor rol, permanente RB1 voorwaardelijke schrapping leidt tot een verscheidenheid van tumoren11. Hoewel een DN versie van RB1 niet van nature lijkt, een beter alternatief voor de momenteel beschikbare strategieën moet voorzien in een stoffelijk gecontroleerde inactivatie van de endogene RB1 en bieden een alternatief mechanisme te herstellen uiteindelijk haar functie. De basis voor een dergelijke constructie werd meer dan twee decennia geleden beschreven1. Echter, als gevolg van technologische beperkingen het ontbrak een mechanisme voor controle transgenic activering, reactie en weefsel specificiteit. Deze studie is de eerste te combineren de elegantie van de doxycycline (Dox)-afhankelijke transcriptionele systeem met een gemanipuleerde transgene constructie van lysosomale protease CB en Rb1 eiwitten. De resulterende CBRb muismodel zorgt voor een tijdelijk gereglementeerde Dox-gemedieerde RB1 voorschrift2. Het voordeel van het gebruik van een dergelijke Proteoom gebaseerde aanpak om te studeren van genfuncties is dat het voor elke gen van belang, met minimale informatie over haar activiteiten kan worden aangenomen.
De voorgestelde DN transgenic strategie biedt vele voordelen ten opzichte van de traditionele benaderingen. Eerst, DN eiwit remming leidt tot slechts een gedeeltelijke ablatie eiwit activiteit, dus het behoud van een residuele endogene expressie. Zo’n resultaat is zeer wenselijk in situaties waar een volledige eliminatie van eiwit activiteit tot embryonale letaliteit leidt, een onderzoek om te bestuderen van de genfunctie in een levende muis sterk te beperken. Ten tweede, de aanwezigheid van het TetO systeem kunt transgenic activering alleen in aanwezigheid van een antibioticum, dat voor een efficiënte en omkeerbare controle van de transgenic activiteit zorgt. Dus, door op te houden de antibiotica administratie, de transgene systeem kan worden gedeactiveerd, en een normale RB1 expressie is terug op zijn plaats. Ten derde, de specificiteit van de transgenic expressie kan variëren naargelang de promotor van keuze. Terwijl wij hebben besloten de alomtegenwoordige ROSA-CAG-promotor voor bewijs-van-principe, is plaatsen de transgenic onder een weefsel-specifieke promotor waarschijnlijk tot beperking van ongewenste transgenic expressie en vergemakkelijken van studies over de therapeutische toepassing van deze transgenic methodologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wij willen om te omzeilen van de beperkingen die zijn gekoppeld aan de traditionele transgene strategieën, genereren een muismodel waarin een endogene POI kan voorwaardelijk worden geïnactiveerd door overexpressing een DN gemuteerde vorm van het Spatio wijze. Afschaffing van de functie van endogene POI’s, zijn verschillende opties voorgestelde15,16,17. We hebben een eerdere genetische strategie1 bewerkt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De pCS2 + CB-Myc6 vector was een geschenk van Marshall Horwitz (Universiteit van Washington, Seattle, WA, Verenigde Staten). De HEI-OC1 cellen werden beschikbaar gesteld door Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA, USA). Technische ondersteuning werd verstrekt door de UNMC muis genoom Engineering kern (C.B. Gurumurthy, Don Harms, Rolen Quadros) en de Creighton University geïntegreerde Biomedical Imaging faciliteit (Richard Hallworth, John Billheimer). De UNMC Mouse genoom Engineering werd ondersteund door een institutioneel Development Award (idee) van de NIH/NIGMS, verlenen nummer P20 GM103471. De geïntegreerde Biomedical Imaging faciliteit werd gesteund door de Creighton University School of Medicine en subsidies, GM103427 en GM110768 van de NIH/NIGMS. De faciliteit is gebouwd met steun van subsidies uit het National Center for onderzoeksmiddelen (RR016469) en de NIGMS (GM103427). De lijnen van de muis gegenereerd in deze studie werden onderhouden bij Creighton University’s dier Resource faciliteit, waarvan infrastructuur werd verbeterd door middel van een subsidie door de NIH/NCRR G20RR024001. Dit werk ontvangen verleden ondersteuning via een NIH/NCRR 5P20RR018788-/ NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE toekennen (Shelley D. Smith), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S.M.R.-S.) en een opkomende subsidie van het onderzoek van de Hearing Health Foundation (naar S. Tarang). De inhoud van dit onderzoek is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferation kit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 antibody | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antibody | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Phallodin | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescence microplate reader | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescence microscope | NikonEclipse80i | ||
| The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. |
References
- Li, F. Q., et al. Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease. Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).
- Tarang, S., et al. Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model. Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).
- Kominami, E., et al. The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins. FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).
- Cortellino, S., et al. Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4. 발생학. 325 (1), 225-237 (2009).
- Ferreira, C., et al. Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).
- Lee, E. Y., et al. Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis. Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).
- Turlo, K. A., et al. When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss. 유전학. 186 (3), 959-967 (2010).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Zhang, J., et al. The first knockout mouse model of retinoblastoma. Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).
- Zhao, H., et al. Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).
- Yamasaki, L., et al. Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice. Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).
- Li, F. Q., et al. Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).
- Pitkanen, K., et al. Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation. Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).
- Chano, T., et al. Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation. International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).
- Kole, R., et al. RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).
- Yamamoto, A., et al. The ons and offs of inducible transgenic technology: A review. Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).
- Houdebine, L. M., et al. Transgenic animal models in biomedical research. Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).
- Brehm, A., et al. Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription. Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).
- Lu, Z., et al. E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer. Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).
- Magnaghi-Jaulin, L., et al. Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase. Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).
