誘導およびリバーシブルのドミナント ネガティブ (DN) 蛋白質の阻害
Summary
ここで任意のタンパク質をそれのドミナント ネガティブ変異体バージョンを元に戻せる状態 ⓫ 条件付きで不活性化することができます、ドミナント ネガティブ誘導システムを開発するためのプロトコルを提案する.
Abstract
ドミナント ネガティブ (DN) タンパク質阻害タンパク質の機能を操作するための強力な方法は、他のゲノム情報に基づくアプローチに比べていくつかの利点を提供しています。たとえば、キメラがCre LoxPターゲット戦略が広く使用されている、(すなわち、漏れのプロモーター活性、モザイクCre式等)、これらの戦略の本質的な制限は制限が大幅にアプリケーション。また、多くの内在性遺伝子の完全な削除、強肩致命的、生後の遺伝子機能を研究することは不可能です。これらの課題に対処するため我々 は初期遺伝子工学プロトコルを大幅に変更し、ライソゾーム プロテアーゼの Rb1 遺伝子の短い (遺伝子組換え) バージョンの併用 procathepsin B (CB)、Rb1 の DN マウス モデルを生成する (CBRb)。ライソゾーム プロテアーゼの存在のために全体の CB RB1 融合タンパク質およびその相互作用の複合体はプロテアソームを介した分解にルーティングされます。また、遺伝子導入構成体のテトラサイクリン誘導 (情報を頼むこと) 要素の存在により RB1 蛋白質の誘導性かつ可逆的な規制です。CBRb マウス モデルにおけるユビキタス ローザ CAG プロモーターの存在はそれに一時的の Rb1 遺伝子アブレーションを実施し、研究者に事実上任意のセル型での活動を理解するためのリソースを提供する便利なツール、RB1 が表されます。
Introduction
遺伝子および蛋白質の試練を目指すほとんどのアプローチは、一般的に完全な除去や遺伝子、rna、または興味 (POI) の蛋白質の切り捨てにつながる永続的なプロセスに依存します。このメソッドの全体的な目標は、内因性、野生型タンパク質の機能を廃止する組換え蛋白質をエンジニア リングすることです。再訪し、DN の抑制を介してポイの一時的なアブレーションは、代替戦略1,2を刷新しました。このメソッドは、ポリコームタンパクと単量体ペプチドの両方のために働くが、ポリコームタンパク アセンブリ内で機能する蛋白質に最適です。
メソッドは、溶断ポリコームタンパク ポイ (CB 融合タンパク複合体) のサブユニットにライソゾーム プロテアーゼ CB で構成されます。複雑な結果の CB の融合との対話し生内因性のタンパク質を消化したり劣化3リソソームに全体の CB-POI の複合体をそらします。また、テトラサイクリン制御転写活性化 (重音テト) 系の誘導の自然と、CB 融合タンパク複合体の組み合わせは、リバーシブル ファッション2遺伝子の誘導と制御式にできます。多くの状況で有用遺伝子または蛋白質の生体内での完全な削除は致死率4,5,6で起因できます。同様に、それは最終的には、重要なゲノムの要素7の永久的な損失につながるのいくつかの遺伝子または蛋白質 Cre/Lox システムを使用して組織に固有の条件付きの削除は簡単にできません。したがって、遺伝子や POI によってこれらのアプローチのどちらも有効であるその後の研究のための有用なモデルを提供する特に遺伝子または蛋白質の後半の産後と大人のマウスの機能の研究。
提案手法の有効性に関する証拠の原則そのようなアプローチに関連する問題を回避し、提供、我々 は網膜芽細胞腫 1 (RB1) 蛋白質の条件付き DN バージョンを生成することによって、ここで紹介する方法をテストする分野します。いくつかのオプションは、内因性 RB1 の機能を廃止する提案8,9,10をされています。しかし、それらのすべての上記で説明した同じ制限に直面: RB1 の永久的な生殖削除は強肩致死、その腫瘍サプレッサーの役割と永続的な一貫性のある RB1 条件付き削除へとつながって様々 な腫瘍11。にもかかわらず、RB1 の DN バージョンは、自然に発生するとは思えない、現在利用可能な戦略をより良い代替手段が内因性の RB1 の一時的に制御された不活性化を可能にする、最終的に復元する別のメカニズムを提供する、関数。そのような構築のための基礎は前に二十年以上に述べた1。ただし、技術的な制限のためには組織特異性、応答制御遺伝子の活性化機構を欠けていた。本研究ではドキシサイクリン (Dox) の優雅を結合する最初のライソゾーム プロテアーゼ CB とRb1蛋白質の組み換え遺伝子組換えコンストラクト依存転写システム。結果の CBRb マウス モデルは、一時的に規制 Dox を介した RB1 規制2。プロテオーム ベースのアプローチを使用して遺伝子の働きを研究するの利点は、それがその活動を最小限の情報で関心の任意の遺伝子が採用されることがあります。
DN 遺伝子手法では、従来の方法に比べて多くの利点を提供しています。まず、DN タンパク質阻害は蛋白質の活動、したがって残留内因性表現を維持にのみ部分的なアブレーションに します。そのような結果は蛋白質の活動の完全な除去が胚性致死率は、大きく生きているマウスの遺伝子の機能を研究する任意の調査を制限することにつながるような状況で非常に望ましい。第二に、重音テト システムの存在は、遺伝子活動の効率的かつ可逆的な制御が可能の抗生物質の存在下でのみ遺伝子活性化できます。したがって、抗菌薬の投与を中止、形質転換システムは非アクティブにできますと通常の RB1 式は元の場所に。第三に、導入遺伝子発現の特異性は、任意のプロモーターによって異なります。原理実証のためのユビキタス ローザ CAG プロモーターをいただいて、組織固有のプロモーター遺伝子を配置することは不要な遺伝子発現を制限し、この遺伝子治療への応用に関する研究を促進する可能性が高い方法論。
Protocol
Representative Results
Discussion
伝統的な形質転換戦略に関連付けられている制限を回避するために我々 は内因性ポイを時空間的にそれの DN の変異形を ⓫ 条件付きで不活性化することができますマウス モデルを生成しようと思う。内因性のランドマークの機能を廃止するには、いくつかのオプションは、15,,16,17をされています。式の表現に影響を与え?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PCS2 + CB Myc6 ベクトルだったマーシャル ・ ホロウィッツ (ワシントン大学, シアトル、ワシントン州、米国) からの贈り物。丙 OC1 セルは、Fedrico Kalinec (デイヴィッド ・ ゲフィン医学カリフォルニア大学ロサンゼルス校、ロサンゼルス、カリフォルニア、米国) によって提供された親切。テクニカル サポートは、UNMC マウスのゲノム工学中心 (C.B. Gurumurthy、ドンは害を与える、・ ローレン クアドロス)、クレイトン大学統合医学イメージング施設 (リチャード ・ Hallworth、ジョン ・ Billheimer) によって提供されました。番号 P20 GM103471 を付与 UNMC マウスのゲノム工学の NIH/日の出から機関の開発賞 (アイデア) 支えられました。統合生体イメージング施設は、クレイトン大学医学部医学科 GM103427 と NIH/日の出から GM110768 の補助金によって支えられました。研究資源 (RR016469) センターからの助成金からの支援で建設された施設と日の出 (GM103427)。本研究では生成されたマウスの行は、クレイトン大学動物資源機能、NIH/NCRR/G20RR024001 での助成金による向上とその経済基盤で維持されました。この作品は、過去の NIH/NCRR/5P20RR018788-/NIH/日の出 8P20GM103471 COBRE 付与 (シェリー d. スミス) に、NIH/ORIP R21OD019745 01A1 (滿 s.)、および (S. Tarang) に公聴会健康づくり財団から新興の研究助成による支援を受けた。本研究の内容は著者の責任し、国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferation kit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 antibody | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antibody | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Phallodin | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescence microplate reader | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescence microscope | NikonEclipse80i | ||
| The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. |
References
- Li, F. Q., et al. Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease. Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).
- Tarang, S., et al. Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model. Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).
- Kominami, E., et al. The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins. FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).
- Cortellino, S., et al. Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4. 발생학. 325 (1), 225-237 (2009).
- Ferreira, C., et al. Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).
- Lee, E. Y., et al. Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis. Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).
- Turlo, K. A., et al. When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss. 유전학. 186 (3), 959-967 (2010).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Zhang, J., et al. The first knockout mouse model of retinoblastoma. Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).
- Zhao, H., et al. Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).
- Yamasaki, L., et al. Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice. Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).
- Li, F. Q., et al. Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).
- Pitkanen, K., et al. Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation. Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).
- Chano, T., et al. Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation. International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).
- Kole, R., et al. RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).
- Yamamoto, A., et al. The ons and offs of inducible transgenic technology: A review. Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).
- Houdebine, L. M., et al. Transgenic animal models in biomedical research. Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).
- Brehm, A., et al. Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription. Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).
- Lu, Z., et al. E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer. Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).
- Magnaghi-Jaulin, L., et al. Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase. Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).
