פרוטוקול זה מתאר את השימוש שבבי פלסטיק תרבות, ממדר אותם נוירונים מאתר העיקרי. . הצ’יפס הזה preassembled, ידידותי למשתמש, תואם עם רזולוציה גבוהה, לחיות, קרינה פלואורסצנטית והדימות. פרוטוקול זה מתאר את אופן צלחת החולדה הנוירונים בהיפוקמפוס בתוך הצ’יפס הזה ולבצע בידוד fluidic, axotomy ו- immunostaining.
Microfabricated שיטות להפריד נוירונים הפכו לכלי חיוני עבור מדעני מוח רבים. פרוטוקול זה מתאר את השימוש שבב זמינים מסחרית פלסטיק מראש עבור ממדר נוירונים בהיפוקמפוס החולדה הראשית בתרבית. פלסטיק, הנכלל עם טביעת רגל של שקופית מיקרוסקופ רגיל, הצ’יפס הזה תואם ברזולוציה גבוהה, לחיות, קרינה פלואורסצנטית והדימות. פרוטוקול זה מדגים כיצד ייסוג תווית הנוירונים באמצעות אקסונים מבודדים באמצעות וירוס הכלבת ששונה קידוד החלבון הניאון, ליצור microenvironments מבודדים בתוך תא אחד ולבצע axotomy ו- immunocytochemistry על שבב. נוירונים מתורבתים בשביל > 3 שבועות בתוך שבבי פלסטיק, הממחישות את התאימות של האסימונים עבור תרבויות עצביים לטווח ארוך.
התרבות המסורתית נוירון ניגש תוצאה תוצר אקראי של אקסונים, דנדריטים, למנוע את המחקר של נוירונים במורפולוגיה מקוטב הייחודי שלהם. התקנים multicompartment Microfabricated הפכו כלי מחקר ומבוססת ומשמש היטב עבור מדעני מוח בשנים 10-15 (פרסומים בעלי פרופיל גבוה הם המופנה1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17)-התקנים אלה ממדר אותם נוירונים ומספקות שיטה פיזית, כימית לתפעל את האזורים subcellular של הנוירונים, כולל somata, דנדריטים, אקסונים של הסינפסות18,19. הם גם מספקים מרובים פרדיגמות ניסיוני זה אינן אפשריות באמצעות תרביות אקראי, כולל מחקרים של תחבורה עצב, סינתזה של חלבון עצב, האקסון פציעה/התחדשות, והאיתות האקסון-כדי-סומא. ההגדרות הבסיסיות של 2-תא מורכב בשני ערוצים במקביל microfluidic מופרדים על ידי סדרה של microgrooves בניצב קטנים יותר. ראשי או תאי גזע-derived הנוירונים הם מצופה לאחד הערוצים microfluidic, ליישב, לצרף מהמשטח התחתון של המכשיר, ומתחו neurites במרוצת הימים. קונוסים צמיחה רבים מוצאים את דרכם לתוך microgrooves, אשר הם קטנים מספיק שהם מונעים תא גופות מלהיכנס. בגלל הצמיחה קונוסים מוגבלת פיזית ולא יכולתי להסתובב בתוך microgrooves, הם גדלים ישר לתוך התא הסמוך (תא עצב) איפה הם מבודדים.
מבחינה היסטורית, התקנים אלה יצוק באמצעות poly(dimethylsiloxane) (PDMS) של תבנית הבסיס photolithographically בדוגמת הן עשה בתוך הבית במעבדות של חוקרים או לרכוש באופן מסחרי. אחד החסרונות העיקריים של שימוש PDMS הוא hydrophobicity שלה20. PDMS יכול להתבצע הידרופילית באופן זמני, אבל אז במהירות הופך הידרופובי בתוך שעות ב-מימית לסביבה20. מסיבה זו, המכשירים יש לצרף coverslip של זכוכית או מצע מתאים אחרים בזמן השימוש. מראש שבבי multicompartment פלסטיק נמצאים כעת זמינים מסחרית (למשל, XonaChips) בהזרקת פלסטיק. השבבים האלה נעשים הידרופילית לצמיתות, פישוט הרטבה מכשיר ומאפשר הרכבה טרום של השבב עם סרט דק של קופולימר אולפין מחזורית (קוק) תוחמת את ערוצי microfluidic על החלק התחתון. השבבים האלה מיוצרים בפלסטיק שקוף אופטית מתאימה דימות ברזולוציה גבוהה זריחה.
המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים את השימוש האסימונים microfluidic פלסטיק מראש עבור מספר פרדיגמות ניסיוני המבוצעת באמצעות מאתר נוירונים בהיפוקמפוס או קליפתי. פרוטוקול זה מתאר כיצד ייסוג תווית הנוירונים באמצעות וירוס הכלבת ששונה בתוך השבב. גם מתוארים Axotomy ללימודים של האקסון פציעה והתחדשות. לבסוף, פרוטוקול זה מראה כיצד לבצע immunostaining זריחה עם המכשיר.
שבבי multicompartment פלסטיק מספקים אפשרות נוחה לשימוש עבור ממדר הנוירונים, מתן תרבויות עצביים לטווח ארוך (> 3 שבועות). פרוטוקול זה מפרט כיצד תרבות קורטיקליים ו בהיפוקמפוס מאתר נוירונים בתוך למעשיהם. היצירה של microenvironments מסיסים וכיצד ייסוג תווית נוירונים, לבצע axotomy, ולבצע immunocytochemistry נדונו גם. חשוב, הצ’יפס הזה תואם ברזולוציה גבוהה, קרינה פלואורסצנטית והדימות בשידור חי.
שבבי multicompartment פלסטיק מספקים רבים של אותן פונקציות של המכשירים ממודר מבוססי PDMS, אבל יש יתרונות, חסרונות, ועוד כמה תכונות הבחנה. טבלה 1 מספק השוואה תכונה של שבב פלסטיק וגם מכשירים מבוססי PDMS. בראש ובראשונה, האסימונים הם מראש התאספו ועשה לצמיתות הידרופיליות, אשר מקלה על הרטבה, שהופך אותם קל יותר לשימוש. הפלסטיק הוא לא חדיר, בניגוד PDMS, גז אז אם בועות יוצרות באופן בלתי צפוי בתוך הערוצים, הם לא בורחים בקלות ויש להסירו. פתרון ציפוי קדם המכיל בעיקר אתנול וביו -כמה סוכנים קנייניים אחרים מונע היווצרות בועה.
חיים הדמיה של הקרנות הבאה התמרה חושית של חלבונים פלורסנט בוצעה בתוך הצ’יפס (איור 4) ולא היה שום autofluorescence לזיהוי של הפלסטיק. אזהרה היא כי שמנים טבילה עם השבב שימשו מטרות מפתח נומרי גבוהה חייבת להיות על בסיס שמן סיליקון, שמן מינרלי לא מבוסס. שמן מינרלי יכול לגרום תגובה נגדית עם קופולימר אולפין מחזורית. עבור הדמיה brightfield, חשוב לציין כי microgrooves בשבב מעוגלים בקצוות יש מתחדדת הדרגתית של z-לכיוון של הערוצים הראשי לכיוון המחסום microgroove גורם קצת השתברות האור בשני צידי microgrooves במהלך brightfield הדמיה (איור 3). בגלל השבב הוא מראש, נוגדן לחדירה microgrooves בגודל מיקרון עשוי להיות לא אחידה (כמו עם מכשירים מבוססי PDMS לצמיתות בונדד); לפיכך, ניתוח כמותי בעקבות immunostaining צריכה להתבצע בתאים/הערוצים. ניתן לשפר Immunostaining של תחזיות עצביים בתוך microgrooves על-ידי יצירת שינוי נפח בין התאים כדי לסייע הזרימה של נוגדנים fluorophores לתוך microgrooves.
The authors have nothing to disclose.
המחברים לאשר סיוע טכני או העריכה של טיילור ווילט (Xona), Paranjape רחלי אמבר (UNC-בצ’אפל היל), ג’ויס Ciechanowski (Xona), בראד טיילור (Xona). המחברים להכיר תמיכה מיקרופלואידיקה Xona, LLC, את נבחרת המכון לבריאות הנפש (R42 MH097377). הדמיה מומן בחלקו על ידי Confocal ו Multiphoton הדמיה הליבה מתקן של NINDS מרכז גרנט P30 NS045892 NICHD מרכז גרנט (U54 HD079124). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.
XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC150 | 150 µm length microgroove barrier |
Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier | |
Xona Microfluidics, LLC | XC900 | 900 µm length microgroove barrier | |
XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
XonaPDL | Xona Microfluidics, LLC | XonaPDL | |
E17/E18 timed pregnant Sprague Dawley rats | Charles River | 24100564 | |
neuronal culture media: | |||
– Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
-B-27 Plus Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | A3582801 | |
-GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
-Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | |
fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-mCherry | Material Transfer Agreement required | |
Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
Pierce 16% formaldehyde | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
PBS (10x) | ThermoFisher Scientific | QVC0508 | |
normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 16210064 | |
triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
Spinning disk confocal imaging system | Andor Technology | CSU-X1, iXon X3 EMCCD | 60x silicone oil & 20x objectives |
Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |