Isolering af CD4+ T-celler og analyse af cirkulerende T-follikulært Helper (cTfh) celle Subsets fra perifert blod ved hjælp af 6-farve Flow flowcytometri

Summary

Her, en protokol til isolering og karakterisering af CD4⁺ T-celle subsets fra humant perifert blod er beskrevet. Renset CD4⁺ T-celler er analyseret ved flowcytometri at bestemme andelen af T-follikulært hjælper celle subsets.

Abstract

Afvigende T-follikulært helper (Tfh) celleaktivitet kan spores i autoimmune sygdomme og deres tilstedeværelse er forbundet med kliniske resultater, når lymfeknude mikromiljø i B-celle non-Hodgkins lymfom er analyseret. Delmængder af cirkulerende T-follikulært helper celler (cTfh), den cirkulerende hukommelse rum af Tfh celler i blodet, er også rystet i sygdom og derfor repræsenterer potentielle roman prædiktive biomarkører. Perifere blod-baserede test er fordelagtig, fordi det er relativt non-invasiv og giver mulighed for simpel serie overvågning. I denne artikel beskrives en metode til at isolere CD4⁺ T-celler fra humant blod, og yderligere analyser ved flowcytometri at optælle cTfh celler og deres forskellige delgrupper proportioner (cTfhPD-1^{-/ +/ Hej}, cTfh1, 2, 17 og cTfh1/17). Niveauet for disse delmængder blev derefter sammenlignet mellem normale forsøgspersoner og patienter med lymfom. Vi fandt, at metoden var robust nok til at få pålidelige resultater af rutinemæssigt indsamlede patient materiale. Den teknik vi beskrive for analysen kan tilpasses nemt til celle sortering og downstream applikationer som RT-PCR.

Introduction

T-follikulært helper celler (Tfh) er et CD4⁺ T-celle delmængde, der var i starten præget i lymfoide væv¹. Disse celler express PD-1 og CXCR5 overflade receptorer, udskiller IL-21 og IL-4 og Vis nukleare udtryk for transkriptionsfaktor, BCL-6^2,3. Som navnet antyder, de findes i Kimcentre og er afgørende for høj affinitet antistof produktion¹.

Dysregulated Tfh svar har været impliceret i sygdom patogenese, især autoimmun sygdom, hvor de fremmer udbredelsen af autoreactive B celler⁴. De spiller også en rolle i tumor mikromiljø både solid^5,6 og lymfoide kræftformer⁷. Omvendt, genetiske defekter af overflade proteiner afgørende for Tfh fungere som inducerbar T-celle costimulator (ICOS) resultatet i human immundefekt syndromer⁸. CD4⁺ CXCR5⁺ celler i perifert blod kaldes cirkulerende T-follikulært helper celler (cTfh) og menes at være den hukommelse rum af Tfh celler i væv⁹. Formålet med metoden beskrevet her er analysen af cTfh delmængder efter CD4⁺ celle isolation fra perifert blodprøver.

Flere cTfh delmængder er blevet defineret og den effektivitet, hvormed de giver hjælp til B-celle adskiller sig fra et undersæt til en anden^9,10,11,12. Det relative indhold af disse delmængder er ændret i en række sygdomme, mest fremtrædende autoimmun sygdom, hvor der er næsten altid en relativ stigning i den mere funktionelle PD-1^{/ Hej} og/eller cTfh2 eller cTfh17 delmængder i forhold til mindre funktionelle PD-1^– og/eller cTfh1 delmængder¹². Omfanget af disse ændringer ofte forbinder med kliniske parametre, herunder sygdom aktivitet og autoantistof titers, der angiver en potentiel rolle af cTfh delmængde distribution som en prognostiske biomarkør i sygdom, som kan reflektere aktiviteten af Tfh i lymfoide væv^9,12,13,14. Derudover tager blodprøver fra deltagerne er hurtig, sikker og acceptabel, og så tillader serie overvågning til analyse af sygdomsprogression eller reaktion på behandling.

Brug af isolerede CD4⁺ T-celler over traditionelle perifert blod mononukleære celler (PBMNC) suspensioner giver mulighed for højere overførselshastighed flow flowcytometri eksperimenter ved at reducere tidsforbruget til at erhverve et betydeligt antal cTfh celler til analyse. Dette er især nyttigt, når sortering celler fra sjældne cTfh delmængder bruge flow aktiveret celle sortering (FACS). For at støtte effektiviteten, kan disse suspensioner cryopreserved for at aktivere “dosering” af prøver, der skal bruges i flow flowcytometri eksperiment. For afprøvning, CD4⁺ renhed ikke reduceret med kryopræservering.

Mens forskellige laboratorier anvendes forskellige markører til at kategorisere cTfh celler i de tidlige faser af deres opdagelse, metoden, der præsenteres her gør brug af en samlet ordning af to grupper af celle-overflade markører som foreslået af Schmidt et al.^{12, 15} til samtidige identifikation af cTfh og deres ni anerkendte delmængder i en enkelt flowcytometri eksperimentere.

Som eneste celle overflade markører bruges, cellerne kræver ikke fiksation eller permeabilization, og dermed kan forblive i live for downstream funktionelle studier. Dette kunne lettes af cellen sortering ved hjælp af FACS med panelet samme antistof. Dette panel kunne udvides til at omfatte andre markører, giver mulighed for begrænsninger af flow forskellige bliver brugt.

Analyse af multi-farve flow flowcytometri eksperimenter kan være udfordrende på grund af gating på 2-dimensionelle dot parceller, især når cellepopulationer ikke har en klar bi-modal fordeling i markør fluorescens, som er i sagens natur subjektive karakter af tilfældet for cTfh celler og deres undersæt. Derfor er det bydende nødvendigt at etablere effektiv kontrol at reducere kunstgenstande aktiverer bedre opløsning af befolkninger og indstille gating strategier trygt. Som sådan antistof panel design og opsætning af grundlæggende styringer til en flowcytometri eksperimentere, dvs., ved hjælp af kompensation og FMO kontrolelementer er skitseret i trin 3.4.2 og 3.4.3,respectively.

Alle cTfh celler er defineret som CD4⁺ CXCR5⁺ CD45RA^–. Udtryk for den karakteristiske Tfh aktivering markør PD-1 kan derefter blive fastsat til at identificere delmængder af PD-1^–, PD-1⁺ eller PD-1^Hej cTfh celler. Derefter, ved hjælp af en kombination af chemokine receptorer CXCR3 og CCR6, som udtrykkes varierende af traditionelle Th1, 2 eller 17 celler, cTfh kan karakteriseres som cTfh1, 2 eller 17-lignende af en profil af CXCR3⁺ CCR6^–, CXCR3^– CCR6^– , og CXCR3^– CCR6⁺, henholdsvis.

Panelet antistof bruges af vores laboratorium vises i tabel 1. Brugeren kan have til at tilpasse deres fluorophore udvalg for at tage hensyn til laser og lys filter konfiguration findes på deres lokale flow Flowcytometret.

Følgende overvejelser påvirke valget af fluorophores. Brug lyse fluorophores, hvor det er muligt. Især bruge den klogeste tilgængelige fluorophores på de dimmest (mindre stærkt udtrykt) markører. Lysdæmper markører omfatter PD-1, CXCR3 og CCR6, og i mindre grad, CXCR5. Vi specifikt gjort brug af den nyere BB, BV og BUV fluorophores, som giver fremragende lysstyrke og dermed gøre det muligt lettere opløsning af forskellige populationer af cellerne.

Fordelt fluorophore udvalg på emission spectra så vidt muligt at minimere spektrale overlapning og dermed erstatningens størrelse kræves. En gratis, online-værktøj, der kan bruges til at hjælpe designe et flow flowcytometri panel kan findes her: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. For at spare plads på emission spektrum, vi ansat en “dump kanal” ved hjælp af en levedygtighed farvestof med en emission bølgelængde, der overlapper med de APC-H7 (konjugeret til CD45RA) for at aktivere begge døde påvisning (og udstødelse) og/eller CD45RA⁺ ved hjælp af en enkelt detektor.

Her præsenteres en protokol for isolation af perifert blod CD4⁺ T-celler og deres efterfølgende analyse ved flowcytometri til at bestemme de forskellige og for nylig beskrevet cirkulerende delmængder proportioner.

Protocol

Blodprøver blev indhentet fra normale individer (NS) (n = 12) og patienter med marginal zone lymfom (MZL) (n = 7) og andre former for B-celle non-Hodgkins lymfom (BNHL) (6 FL patienter, 2 lymphoplasmacytic lymfom patienter og 1 lav-grade B-celle non-Hodgkins lymfom ikke andetsteds specificeret patient). Patienter blev rekrutteret fra hæmatologi klinikker på Leicester Royal Infirmary efter at have givet informeret, skriftligt samtykke, med etisk godkendelse på plads for alle studier. Etisk godkendelse blev opnået ved…

Representative Results

Høj CD4+ renhed blev opnået ved hjælp af CD4+ isolation protokol, som var pålidelige på tværs af alle blodprøver testet af os (mener: 96,6%, SD: 2,38, n = 31) (figur 3). Identifikation af cTfh (CD4+ CXCR5+ celler) i en repræsentativ normale emnet præsenteres (figur 4A). Andel af total cTfh celler i CD…

Discussion

Denne protokol udgør en enkel og effektiv måde at analysere perifert blod cTfh celler, muliggør påvisning af alle relevante delmængder identificeret i litteraturen hidtil. Blodprøver kan opnås nemt og effektivt som standard Ambulant klinikker og serie prøver kan blive indsamlet parallelt med kliniske data. Igen, giver dette Fremtidsstudier evaluering cTfh delmængder som biomarkører for sygdomsprogression og respons på behandlingen. Disse undersøgelser ville være særlig berettiget i sygdommen hvor Tfh dysreg…

Materials

RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL TECHNOLOGIES	15062
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare Life Sciences	17144003
BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3	BD Horizon	565223
BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9	BD Horizon	563923
BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2	BD Horizon	562747
BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone  RPA-T4	BD Horizon	564419
PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4	BD Pharmingen	557946
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone  HI100	BD Pharmingen	560674
LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	ThermoFisher Scientific	L34973
Brilliant Stain Buffer	BD Horizon	563794
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD CompBead	552843
FACS Aria II Flow Cytometer	BD Biosciences	644832
FACSDiva 6.1.3	BD Biosciences	643629	Flow Cytometer Acquisition Software
FlowJo 10.2	Treestar Inc.		Flow Cytometry Data Analysis Software
Anti-CXCR3 antibody	BD Horizon	565223
Anti-CCR6 antibody	BD Horizon	563923
Anti-CXCR5 antibody	BD Horizon	562747
Anti-CD4 antibody	BD Horizon	564419
Anti-PD-1 antibody	BD Pharmingen	557946
Anti-CD45RA antibody	BD Pharmingen	560674
Viability Marker	ThermoFisher Scientific	L34973