Isolierung von CD4+ T-Zellen und Analyse von zirkulierenden T-follikulären Helfer (cTfh) Zelle Teilmengen von peripheren Blut mittels 6-Farb Flow Cytometry
Summary
Hier, ein Protokoll für die Isolierung und Charakterisierung von CD4+ T-Zelle Teilmengen aus menschlichen peripheren Blut wird beschrieben. CD4 gereinigt+ T-Zellen werden analysiert, indem Durchflusszytometrie Proportionen des follikulären T Helfer-Zelle Teilmengen zu bestimmen.
Abstract
Aberrante T follikulären Helfer (Tfh)-Zell-Aktivität ist im autoimmunen Bedingungen nachweisbar und ihre Anwesenheit ist mit klinischen Resultaten verbunden, wenn die Lymphknoten Mikroumgebung in B-Zell non-Hodgkin Lymphom analysiert wird. Teilmengen der zirkulierenden T-Helfer Follikelzellen (cTfh), die zirkulierenden Speicherkartenfach Tfh Zellen im Blut, sind auch bei Krankheit gestört und daher potenzielle neue Prädiktive Biomarker dar. Peripheren Blut-basiertes Testen ist vorteilhaft, weil es relativ nicht-invasiv und einfache Serienüberwachung ermöglicht. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Isolierung von CD4+ T-Zellen aus menschlichen Blut und weitere Analysen von Durchflusszytometrie, cTfh Zellen und die Proportionen von ihren verschiedenen Teilmengen auflisten (cTfhPD-1-/ + / Hallo, cTfh1, 2, 17 und cTfh1/17). Das Niveau dieser Untergruppen wurde dann zwischen gesunden Probanden und Patienten mit Lymphom verglichen. Wir fanden, dass die Methode robust genug, um routinemäßig erhobenen Patientenmaterial zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Die Technik, die wir für die Analyse beschreiben kann leicht Zellsortierung und downstream-Anwendungen wie RT-PCR angepasst werden.
Introduction
T-Helfer Follikelzellen (Tfh) sind eine CD4+ T-Zell-Untergruppe, die zunächst im lymphatischen Gewebe1gekennzeichnet war. Diese Zellen express PD-1 und CXCR5 Oberfläche Rezeptoren, sezernieren IL-21 und IL-4 und zeigen nuklearen Expression des Transkriptionsfaktors, BCL-62,3. Wie ihr Name schon sagt, sie sind in germinal Center gefunden und sind unerlässlich für hohe Affinität Antikörper Produktion1.
Dysregulated Tfh Antworten waren in der Pathogenese der Krankheit, vor allem Autoimmun-Krankheit, verwickelt, wo sie den Ausbau der autoreaktiven B-Zellen-4zu fördern. Sie spielen auch eine Rolle in der Tumor-Mikroumgebung von solid5,6 und lymphatischen Krebserkrankungen7. Umgekehrt funktionieren Gendefekte Oberflächenproteine für Tfh z. B. induzierbaren T-Zelle Costimulator (ICOS) Ergebnis in menschlichen Immunodeficiency Syndrome8. CD4+ CXCR5+ Zellen im menschlichen peripheren Blut sind zirkulierende T-Helfer Follikelzellen (cTfh) bezeichnet und werden geglaubt, um das Speicherkartenfach der Tfh Zellen im Gewebe9sein. Die hier beschriebene Methode dient der Analyse der cTfh Teilmengen nach CD4+ Zell-Isolierung aus peripherem Blutproben.
Mehrere cTfh Teilmengen definiert wurden und die Effizienz, mit der sie B-Zell-Hilfe bieten, unterscheidet sich von einer Teilmenge um weitere9,10,11,12. Die relativen Anteile der diese Teilmengen werden in einer Reihe von Krankheiten, die meisten prominent Autoimmun-Krankheit, es fast immer eine relative Zunahme der funktioneller PD-1 ist verändert+ / Hallo /oder cTfh2 oder cTfh17 Teilmengen im Vergleich zu den weniger funktionale PD-1– und/oder cTfh1 Teilmengen12. Das Ausmaß dieser Veränderungen häufig assoziieren mit klinischen Parametern einschließlich Krankheit Aktivität und Autoantikörper-Titer, zeigt eine mögliche Rolle der cTfh Teilmenge Verteilung als prognostische Biomarker in Krankheit, die die Tätigkeit der Tfh in wiedergeben kann lymphatischen Gewebe9,12,13,14. Darüber hinaus Blutentnahme von Teilnehmern ist schnell, sicher und akzeptabel, und ermöglicht so serielle Überwachung für die Analyse der Krankheitsprogression oder Ansprechen auf die Therapie.
Die Verwendung von isolierten CD4+ T-Zellen über traditionelle peripherem Blut mononukleären Zellen (PBMNC) Suspensionen ermöglicht höhere Durchsatz Flow Cytometry Experimente reduziert den Zeitaufwand für eine beträchtliche Anzahl von cTfh Zellen für die Analyse zu erwerben. Dies ist besonders hilfreich, wenn Zellen aus seltenen cTfh Teilmengen mit Flow sortieren Zelle sortieren (FACS) aktiviert. Um die Effizienz zu unterstützen, können diese Suspensionen kryokonserviert werden damit “Dosierung” der Proben in den Flow Cytometry Experiment verwendet werden kann. Beim Testen der CD4+ Reinheit wurde nicht durch Kryokonservierung reduziert.
Während verschiedene Labors verwendet verschiedene Marker cTfh Zellen in den frühen Stadien ihrer Entdeckung, die Methode zu kategorisieren hier präsentiert nutzt eine einheitliche Regelung von zwei Gruppen der Zelloberfläche Marker wie vorgeschlagen von Schmidt Et Al.12, 15 ermöglichen die gleichzeitige Ermittlung der cTfh und ihre neun anerkannten Teilmengen in einer einzigen Durchflusszytometrie experimentieren.
Als einzige Zelle Oberflächenmarker verwendet werden, die Zellen benötigen keine Fixierung oder Permeabilisierung und können somit für nachgeschaltete funktionelle Studien lebendig bleiben. Dies könnte durch Zelle sortieren mit FACS mit dem gleichen Antikörper-Panel erleichtert werden. Dieses Panel könnte anderen Markern, zulassend die Einschränkungen der verwendeten Durchflusszytometer ausgeweitet werden.
Die Analyse der Multi-Color Flow Cytometry Experimente kann aufgrund der von Natur aus subjektiven Anspritzung auf 2-dimensionale Punkt plottet, vor allem als Zell-Populationen eine klare Bi-modale Verteilung Marker Fluoreszenz, da müssen nicht schwierig sein die bei cTfh Zellen und ihrer Untergruppen. Aus diesem Grund ist es zwingend notwendig, um wirksame Kontrollen einrichten, um die Artefakte ermöglichen besseren Auflösung von Populationen und gating Strategien selbstbewusst zu reduzieren. Als solche Antikörper-Panel-Design und den Aufbau der grundlegenden Steuerelemente für eine Durchflusszytometrie experimentieren, d. h. mit Entschädigung und FMO Kontrollen in Schritt 3.4.2 und 3.4.3,respectively beschrieben werden.
Alle cTfh Zellen sind definiert als CD4+ CXCR5+ CD45RA–. Das Niveau der Ausdruck des charakteristischen Tfh Aktivierung Markers PD-1 kann dann bestimmt werden, um die Teilmengen von PD-1–, PD-1+ oder PD-1Hallo cTfh Zellen zu identifizieren. Dann, mit einer Kombination von Chemokin-Rezeptoren CXCR3 und CCR6, die differenziell ausgedrückt werden durch traditionelle Th1, 2 bis 17 Zellen, cTfh kann charakterisiert werden als cTfh1, 2 bis 17-wie durch ein Profil von CXCR3+ CCR6–, CXCR3– CCR6– , und CXCR3– CCR6+, beziehungsweise.
Die Antikörper-Panel von unserem Labor verwendet wird in Tabelle 1angezeigt. Die Benutzer müssen ihre Fluorophor-Auswahl, um für die Laser und Lichtfilter Konfiguration auf ihre lokalen Durchflusszytometer Konto anzupassen.
Die folgenden Überlegungen beeinflussen die Wahl des Fluorophore. Verwenden Sie helle Fluorophore, soweit möglich. Insbesondere verwenden Sie die hellsten verfügbaren Fluorophore auf die dunkelsten (weniger hoch ausgedrückten) Markierungen. Dimmer Markierungen schließen ein PD-1, CXCR3 und CCR6, und in geringerem Maße, CXCR5. Wir speziell nutzte der neueren BB, BV und BUV Fluorophore, die ausgezeichnete Helligkeit und ermöglichen so einfacher Auflösung der unterschiedlichen Bevölkerungen der Zellen.
So weit wie möglich spektrale Überlappung und damit die Höhe der Entschädigung zu minimieren Emissionsspektren die Fluorophor Auswahl verteilt sind. Eine freie, Online-Tool, das verwendet werden kann, gerne entwerfen ein Flow-Zytometrie-Panel finden Sie hier: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. Platzsparend auf das Emissionsspektrum beschäftigten wir einen “Dump-Kanal” mithilfe einer Lebensfähigkeit Färbung mit einer Emissionswellenlänge, die damit die Erkennung (und Ausgrenzung) der beiden Toten zu mit der APC-H7 Überschneidungen (konjugiert, CD45RA) und/oder CD45RA+ mit einem Detektor.
Hier ist ein Protokoll für die Isolierung des peripheren Blutes CD4+ T-Zellen und ihre anschließende Analyse von Durchflusszytometrie zu bestimmen, die Proportionen der verschiedenen und kürzlich beschriebenen zirkulierenden Teilmengen präsentiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll stellt eine einfache und effiziente Möglichkeit, periphere cTfh Blutkörperchen, ermöglicht die Erkennung von allen relevanten Teilmengen identifiziert in der Literatur bisher zu analysieren. Blutproben können einfach und effizient erhalten werden, als Teil des standard ambulante Kliniken und serielle Proben parallel mit klinischen Daten gesammelt werden kann. Dies ermöglicht wiederum, prospektive Studien cTfh Teilmengen als Biomarker für die Progression der Erkrankung oder Reaktion auf die Behandlu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss von Leukämie UK an ETB und MJA.
Materials
| RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL TECHNOLOGIES | 15062 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17144003 | |
| BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3 | BD Horizon | 565223 | |
| BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9 | BD Horizon | 563923 | |
| BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2 | BD Horizon | 562747 | |
| BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone RPA-T4 | BD Horizon | 564419 | |
| PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4 | BD Pharmingen | 557946 | |
| APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone HI100 | BD Pharmingen | 560674 | |
| LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | ThermoFisher Scientific | L34973 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD CompBead | 552843 | |
| FACS Aria II Flow Cytometer | BD Biosciences | 644832 | |
| FACSDiva 6.1.3 | BD Biosciences | 643629 | Flow Cytometer Acquisition Software |
| FlowJo 10.2 | Treestar Inc. | Flow Cytometry Data Analysis Software | |
| Anti-CXCR3 antibody | BD Horizon | 565223 | |
| Anti-CCR6 antibody | BD Horizon | 563923 | |
| Anti-CXCR5 antibody | BD Horizon | 562747 | |
| Anti-CD4 antibody | BD Horizon | 564419 | |
| Anti-PD-1 antibody | BD Pharmingen | 557946 | |
| Anti-CD45RA antibody | BD Pharmingen | 560674 | |
| Viability Marker | ThermoFisher Scientific | L34973 |
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