CD4 の分離+ T 細胞および循環の解析 T 濾胞ヘルパー (cTfh) 末梢血を使用して 6 色フローサイトメトリーから細胞のサブセット
Summary
ここでは、分離と CD4 のキャラクタリゼーションのためのプロトコル+ T 細胞サブセットひと末梢血からの説明。CD4 精製+ T 細胞は濾胞 T のヘルパー細胞のサブセットの割合を決定するためのフローサイトメトリーで分析しました。
Abstract
異常 T 濾胞ヘルパー (Tfh) 細胞活性は自己免疫の条件の検出と B 細胞非ホジキン リンパ腫のリンパ節微小環境を分析するとき、彼らの存在は臨床結果と関連付けられました。循環 T 濾胞ヘルパー細胞 (cTfh)、Tfh 細胞、血液中の循環メモリ コンパートメントのサブセットが病気で混乱も、したがって、潜在的な新規予測バイオ マーカーを表します。末梢血でのテストは、比較的非侵襲的な単純なシリアルを監視できますので便利です。CD4 を分離する方法について説明します+ T 細胞人間の血液さらに cTfh 細胞としてのさまざまなサブセットの割合を列挙するフローサイトメトリーによる解析から (cTfhPD 1-/+ こんにちは、cTfh1、2、17、cTfh1/17)。これらのサブセットのレベルは、リンパ腫と健常者と患者間比較しました。メソッドが定期的に集められた患者材料から信頼性の高い結果を得るに十分な堅牢なことがわかった。分析について述べる技術は、細胞選別と RT-PCR などダウン ストリーム アプリケーションを簡単に適合できます。
Introduction
卵胞 T のヘルパー細胞 (Tfh) は、CD4+リンパ組織1で最初に特徴付けられた T 細胞サブセット。これらの細胞は、PD 1 と CXCR5 表面の受容器を表現、イリノイ 21 と IL-4 を分泌し、BCL 62,3転写因子の核の式を表示します。その名の通り、彼らは胚中心で発見され、1高親和性抗体の生産に欠かせない。
調節不全 Tfh の応答は、病気の発症、4自己反応性 B 細胞の拡大を促進する最も顕著な自己免疫疾患に関与しています。彼らはまた、固体5,6のリンパがん7腫瘍微小環境における役割を果たします。逆に、表面タンパク質 Tfh の必須の遺伝的欠陥は、ひと免疫不全症候群8誘導性 T 細胞 costimulator (アイコス) 結果など機能します。CD4+ CXCR5+ひと末梢血細胞濾胞 T のヘルパー細胞 (cTfh) と呼ばれている、Tfh 細胞組織9のメモリ実装部と考えられています。ここで説明したメソッドの目的は次の CD4 cTfh サブセットの解析+細胞の末梢血から分離。
いくつかの cTfh のサブセットが定義され、彼らが B 細胞の助けを提供効率は異なります 1 つのサブセット別9,10、11,12。これらのサブセットの相対的な割合は、そこでほとんどの目立つように自己免疫疾患がより機能的な PD 1 の相対的な増加ではほとんど常に、病気の数で変更されます+ こんにちは以下と比較して cTfh2 または cTfh17 のサブセットおよび/または機能的な PD-1–および cTfh1 サブセット12。これらの変更の程度は頻繁 cTfh サブセット分布の Tfh のアクティビティを反映可能性があります病気の予後バイオ マーカーとしての潜在的な役割を示す、疾患活動と自己抗体の抗体価を含む臨床パラメーターに関連付けるリンパ組織9,12,13,14。また、参加者からの血液採取は迅速、安全かつ許容できのでシリアル病気の進行や治療への反応の分析のための監視します。
孤立した CD4 の使用伝統的な末梢血単核細胞 (マーカー) 懸濁液上+ T 細胞 cTfh 細胞解析のための相当な数を取得する必要な時間を減らすことによってより高いスループット流れ cytometry 実験を有効にします。これは、セル (FACS) を並べ替え並べ替えの流れを使用して珍しい cTfh サブセットからセルをアクティブになったときに特に便利です。効率化を支援するために””流れの cytometry の実験で使用されるサンプルのバッチ処理を有効にするこれらの懸濁液を凍結保存することができます。テスト、CD4 の+純度は凍結によって減少されていません。
シュミットら12,によって提案されている細胞表面マーカーの 2 つのグループの統一された方式を使用して彼らの発見方法の初期の段階で cTfh 細胞を分類する使用される別の所の別のマーカーはここで紹介中15 cTfh と単一フローサイトメトリーでその 9 認識されたサブセットの同時識別を有効にするのに実験します。
唯一セル表面のマーカーを使用すると、セル固定や透過、不要、したがって下流の機能研究のため生きている残ることができます。FACS を用いた同じ抗体パネルを並べ替え] セルで、これを促進する可能性があります。このパネルは、使用されている流れの cytometer の制限を可能にする他のマーカーを含むように拡張可能性があります。
マルチカラー フロー フローサイトメトリー実験の分析は特に細胞集団が蛍光マーカーとしての明確なバイモーダル分布を持っていない場合, 2次元ドット プロットにゲーティングの本質的に主観的な性質のために挑戦することができます、cTfh 細胞およびそのサブセット用ケース。このため、人口のより良い解決を有効にして自信を持って戦略をゲートを設定する工芸品を減らすために効果的なコントロールを設定することが不可欠です。抗体パネル デザインとフローサイトメトリー用の基本的なコントロールのセットアップ実験、すなわち、補正し FMO コントロールのステップ 3.4.2 および 3.4.3,respectively のとおり。
CTfh のすべてのセルが CD4 として定義されている+ CXCR5+ CD45RA–。特性の Tfh 活性化マーカー PD 1 の表現のレベルは、PD 1–、PD 1+または PD 1こんにちはcTfh セルのサブセットを識別するために決定できます。その後、CCR6 と CXCR3 ケモカイン受容体の組み合わせを使用して、伝統的な Th1、2 または 17 細胞、cTfh によって発現するとして特徴付けられる cTfh1、2 または CXCR3 のプロフィールによって 17 のような+ CCR6–、CXCR3– CCR6–と CXCR3– CCR6+、それぞれ。
私たちの研究室で使用される抗体パネルは、表 1に表示されます。ユーザーは、彼らのローカル流れの cytometer 上使用可能なレーザーと光フィルター構成を考慮して、fluorophore 選択を適応させる必要があります。
次の考慮事項 fluorophores の選択に影響します。できるだけ明るい蛍光物質を使用します。特に、明度 (それほど高い表現) マーカーの最も明るい利用できる蛍光物質を使用します。PD 1、CXCR3 CCR6 などの調光器のマーカーとより少ない程度に、CXCR5。具体的には新しい BB、BV、BUV 使用してフルオロ優れた輝度を提供し、こうして細胞の異なる集団の簡単に解像度を有効にします。
発光スペクトルの重複そしてこうして必要な補償のレベルを最小限に抑えるため可能な限り分散 fluorophore 選択。流れ cytometry パネルの設計を支援するために使用することができます無料、フリー、オンライン ツールをここで見つけることができます: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer。発光スペクトルの領域を節約する両方の死者の検出 (および除外) 有効にする APC h7 (CD45RA に共役) と重なる部分発光波長性色素を用いた「ダンプ チャンネル」を採用または CD45RA+を使用して、単一の検出器。
ここでは、異なると最近記述されているサブセットを循環の割合を決定するためのフローサイトメトリーによる末梢血 CD4+ T 細胞の分離とその後の分析のためのプロトコルが表示されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、これまで文献で識別されるすべての関連するサブセットの検出の有効化、末梢血 cTfh 細胞を分析するシンプルかつ効率的な方法を表します。標準的な外来患者診療所やシリアルのサンプルの一部は、臨床データと並行して集めることができるよう、血液サンプルを簡単に効率的に入手できます。ターンでは、これにより病気の進行や治療への反応のバイオ マーカーとし…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
仕事は、ETB し会員数白血病英国からの助成金によって支えられました。
Materials
| RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL TECHNOLOGIES | 15062 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17144003 | |
| BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3 | BD Horizon | 565223 | |
| BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9 | BD Horizon | 563923 | |
| BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2 | BD Horizon | 562747 | |
| BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone RPA-T4 | BD Horizon | 564419 | |
| PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4 | BD Pharmingen | 557946 | |
| APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone HI100 | BD Pharmingen | 560674 | |
| LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | ThermoFisher Scientific | L34973 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD CompBead | 552843 | |
| FACS Aria II Flow Cytometer | BD Biosciences | 644832 | |
| FACSDiva 6.1.3 | BD Biosciences | 643629 | Flow Cytometer Acquisition Software |
| FlowJo 10.2 | Treestar Inc. | Flow Cytometry Data Analysis Software | |
| Anti-CXCR3 antibody | BD Horizon | 565223 | |
| Anti-CCR6 antibody | BD Horizon | 563923 | |
| Anti-CXCR5 antibody | BD Horizon | 562747 | |
| Anti-CD4 antibody | BD Horizon | 564419 | |
| Anti-PD-1 antibody | BD Pharmingen | 557946 | |
| Anti-CD45RA antibody | BD Pharmingen | 560674 | |
| Viability Marker | ThermoFisher Scientific | L34973 |
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