Isolering av CD4+ T-celler og analyse av sirkulerende T-follicular Helper (cTfh) celle undergrupper fra perifert blod bruker 6-farge Flow cytometri
Summary
Her, en protokoll for isolering og karakterisering av CD4+ T-celle delsett fra menneskelige perifert blod er beskrevet. Renset CD4+ T-celler blir analysert av flowcytometri å bestemme proporsjoner av T-follicular hjelper celle undergrupper.
Abstract
Avvikende T-follicular helper (Tfh) celle aktivitet er i autoimmune tilstander og deres tilstedeværelse er forbundet med kliniske utfall når lymfeknute microenvironment i B-celle non-Hodgkins lymfom er analysert. Delsett av sirkulerende T-follicular hjelper celler (cTfh), den sirkulerende hukommelse avlukke Tfh celler i blodet, er også perturbed i sykdom og derfor representerer potensielle romanen prediktiv biomarkers. Perifert blod-baserte tester er en fordel fordi det er relativt ikke-invasiv og kan enkelt føljetong overvåking. Denne artikkelen beskriver en metode for å isolere CD4+ T-celler fra menneskeblod og videre analyse av flowcytometri nummerere cTfh celler og andelen delmengder ulike (cTfhPD-1-/ / Hei, cTfh1, 2, 17 og cTfh1-17). Hvilket av disse undergrupper ble sammenlignet mellom vanlig fag og pasienter med lymphoma. Vi fant at metoden var robuste nok til å få pålitelige resultater fra rutinemessig innsamlede pasienten materiale. Teknikken vi beskrive for analyse kan enkelt tilpasses til celle sortering og nedstrøms programmer som RT PCR.
Introduction
T-follicular hjelper celler (Tfh) er en CD4+ T-celle delsett som var utgangspunktet preget i lymfoide vev1. Disse cellene uttrykke PD-1 og CXCR5 overflate reseptorer, skiller IL-21 og IL-4 og vise kjernefysiske uttrykk for transkripsjon faktoren, BCL-62,3. Som navnet antyder, de er funnet i germinal sentre og er avgjørende for høy affinitet antistoff produksjon1.
Dysregulated Tfh svar har vært innblandet i sykdom patogenesen, særlig autoimmun sykdom, der de fremmer utvidelsen av autoreactive B celler4. De spiller også en rolle i svulst microenvironment både solid5,6 og lymfoide kreft7. Omvendt, genetiske defekter av overflaten proteiner viktig for Tfh funksjonen induserbart T-celle costimulator (ICOS) resultatet i menneskelig immunsvikt syndromer8. CD4+ CXCR5+ celler i menneskelig perifert blod kalles sirkulerende T-follicular hjelper celler (cTfh) og antas å være hukommelse avlukke Tfh celler i vev9. Formålet med metoden beskrevet her er analysen av cTfh undergrupper etter CD4+ celle isolasjon fra perifert blodprøver.
Flere cTfh delsett er definert og effektiviteten som de gir B-celle hjelp skiller seg fra en undergruppe til en annen9,10,11,12. De relative proporsjonene i disse delsett er endret i en rekke sykdommer, mest fremtredende autoimmun sykdom der det er nesten alltid en økningen i mer funksjonelle PD-1/ Hei og/eller cTfh2 eller cTfh17 delsett i forhold til mindre funksjonell PD-1– og/eller cTfh1 delsett12. Omfanget av disse endringene ofte knytte klinisk parametere inkludert sykdom aktivitet og autoantibody titers, som indikerer en mulig rolle for cTfh delsett distribusjon som en prognostiske biomarkør i sykdom, som kanskje gjenspeiler aktiviteten til Tfh i lymfoid vev9,12,13,14. I tillegg tar blodprøver fra deltakere er rask, sikker og akseptabelt, og så tillater føljetong overvåking for analyse av sykdomsprogresjon eller svar til terapi.
Bruk av isolerte CD4+ T-celler over tradisjonelle perifert blod mononukleære celle (PBMNC) suspensjoner gir høyere gjennomstrømming flyt cytometri eksperimenter ved å redusere tiden det tar å skaffe seg et betydelig antall cTfh celler for analyse. Dette er spesielt nyttig når sortering celler fra sjeldne cTfh delsett med flyt aktivert celle sortering (FACS). For å hjelpe effektiviteten, kan disse suspensjoner være cryopreserved for å aktivere “batching” å brukes i flyt cytometri eksperimentet. På testing, CD4+ renhet ble ikke redusert med kryonisk bevaring.
Mens ulike laboratorier brukes forskjellige indikatorer for å kategorisere cTfh celler i tidlige stadier av deres oppdagelse, metoden presenteres her gjør bruk av en felles ordning av to grupper av celle-overflate markører som foreslått av Schmidt et al.12, 15 aktivere samtidig identifisering av cTfh og delmengder ni anerkjent i en enkelt flowcytometri eksperimenter.
Som eneste celle overflate markører brukes, cellene krever ikke fiksering eller permeabilization, og dermed kan forbli i live for nedstrøms funksjonelle studier. Dette kan ordnes av cellen sortere ved hjelp av FACS med samme antistoff panel. Dette panelet kan bli utvidet til å omfatte andre markører, slik at begrensningene i flyt cytometer brukes.
Analyse av multi-farge flyt cytometri eksperimenter kan være utfordrende på grunn av iboende subjektiv natur gating på 2-dimensjonal dot tomter, spesielt når celle populasjoner har ikke en klar bi-modalt distribusjon i markør fluorescens, som er den tilfellet for cTfh celler og delmengder. Derfor er det viktig å sette opp effektive kontroller å redusere gjenstandene aktiverer bedre oppløsning befolkninger og angi gating strategier trygt. Antistoff panel design og av grunnleggende kontroller for en flowcytometri eksperimenter slik, dvs. bruker kompensasjon og FMO kontroller er skissert i trinn 3.4.2 og 3.4.3,respectively.
Alle cTfh celler er definert som CD4+ CXCR5+ CD45RA–. Hvilket uttrykk for karakteristiske Tfh aktivisering markøren PD-1 kan da bli bestemt å identifisere delsett av PD-1–, PD-1+ eller PD-1Hei cTfh celler. Deretter bruker en kombinasjon av chemokine reseptorer CXCR3 og CCR6, som uttrykkes ulikt tradisjonelle Th1, 2 eller 17 celler, cTfh kan karakteriseres som cTfh1, 2 eller 17-lignende av en profil av CXCR3+ CCR6–, CXCR3– CCR6– , og CXCR3– CCR6+, henholdsvis.
Antistoff panelet brukes av vårt laboratorium vises i tabell 1. Brukeren må tilpasse seg deres fluorophore utvalg kontoen for laser og lys filter konfigurasjon tilgjengelig på deres lokale flyt cytometer.
Følgende hensyn påvirke valg av fluorophores. Bruk lyse fluorophores der det er mulig. Spesielt bruk den smarteste tilgjengelig fluorophores mørkeste (mindre svært uttrykt) markører. Dimmer merkene inkluderer PD-1, CXCR3 og CCR6, og i mindre grad, CXCR5. Vi spesielt gjort bruk av nyere BB, BV og BUV fluorophores som gir utmerket lysstyrke og dermed aktivere enklere løsning av forskjellige populasjoner av cellene.
Spredt fluorophore valget over utslipp spectra så mye som mulig for å minimalisere spectral overlapping, og dermed nivået på kompensasjon. Et gratis, nettbasert verktøy som kan brukes til å hjelpe designe en flyt cytometri panel kan bli funnet her: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. For å spare plass på utslipp spektrum, vi ansatt en “dump kanal” ved hjelp av en levedyktighet farge med et utslipp bølgelengde som overlapper med at av APC-H7 (konjugert til CD45RA) for å aktivere gjenkjenning (og utelukkelse) av både døde og/eller CD45RA+ bruker en enkelt detektor.
Her presenteres en protokoll for isolering av perifert blod CD4+ T-celler og deres påfølgende analyse av flowcytometri til å bestemme ulike og nylig beskrevet sirkulerende delsett.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen representerer en enkel og effektiv måte å analysere perifert blod cTfh celler, slik at påvisning av alle relevante delsett identifisert i litteraturen hittil. Blodprøver kan enkelt og effektivt fås som en del av standard polikliniske klinikker og føljetong prøver kan bli samlet sammen med kliniske data. Igjen, gjør dette prospektive studier vurdere cTfh delsett som biomarkers sykdomsprogresjon eller respons på behandling. Disse studiene ville være spesielt berettiget i sykdom der Tfh feilregul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeidet ble støttet av et stipend fra leukemi UK ETB og MJA.
Materials
| RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL TECHNOLOGIES | 15062 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17144003 | |
| BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3 | BD Horizon | 565223 | |
| BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9 | BD Horizon | 563923 | |
| BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2 | BD Horizon | 562747 | |
| BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone RPA-T4 | BD Horizon | 564419 | |
| PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4 | BD Pharmingen | 557946 | |
| APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone HI100 | BD Pharmingen | 560674 | |
| LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | ThermoFisher Scientific | L34973 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD CompBead | 552843 | |
| FACS Aria II Flow Cytometer | BD Biosciences | 644832 | |
| FACSDiva 6.1.3 | BD Biosciences | 643629 | Flow Cytometer Acquisition Software |
| FlowJo 10.2 | Treestar Inc. | Flow Cytometry Data Analysis Software | |
| Anti-CXCR3 antibody | BD Horizon | 565223 | |
| Anti-CCR6 antibody | BD Horizon | 563923 | |
| Anti-CXCR5 antibody | BD Horizon | 562747 | |
| Anti-CD4 antibody | BD Horizon | 564419 | |
| Anti-PD-1 antibody | BD Pharmingen | 557946 | |
| Anti-CD45RA antibody | BD Pharmingen | 560674 | |
| Viability Marker | ThermoFisher Scientific | L34973 |
References
- Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., MacLennan, I. C. M. Follicular Helper T Cells. Annual Review of Immunology. 34 (1), 335-368 (2016).
- Nurieva, R. I., et al. Bcl6 Mediates the Development of T Follicular Helper Cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
- Breitfeld, D., et al. Follicular B Helper T Cells Express Cxc Chemokine Receptor 5, Localize to B Cell Follicles, and Support Immunoglobulin Production. The Journal of Experimental Medicine. 192 (11), 1545-1552 (2000).
- Linterman, M. A., et al. Follicular helper T cells are required for systemic autoimmunity. The Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 561-576 (2009).
- Bindea, G., et al. Spatiotemporal Dynamics of Intratumoral Immune Cells Reveal the Immune Landscape in Human Cancer. Immunity. 39 (4), 782-795 (2013).
- Gu-Trantien, C., et al. CD4+ follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 2873-2892 (2013).
- Amé-Thomas, P., et al. Characterization of intratumoral follicular helper T cells in follicular lymphoma: role in the survival of malignant B cells. Leukemia. 26 (5), 1053-1063 (2012).
- Bossaller, L., et al. ICOS Deficiency Is Associated with a Severe Reduction of CXCR5+CD4 Germinal Center Th Cells. The Journal of Immunology. 177 (7), 4927-4932 (2006).
- Morita, R., et al. Human Blood CXCR5+CD4+ T Cells Are Counterparts of T Follicular Cells and Contain Specific Subsets that Differentially Support Antibody Secretion. Immunity. 34 (1), 108-121 (2011).
- Locci, M., et al. Human circulating PD-1+CXCR3-CXCR5+ memory Tfh cells are highly functional and correlate with broadly neutralizing HIV antibody responses. Immunity. 39 (4), 758-769 (2013).
- He, J., et al. Circulating Precursor CCR7loPD-1hi CXCR5+ CD4+ T Cells Indicate Tfh Cell Activity and Promote Antibody Responses upon Antigen Reexposure. Immunity. 39 (4), 770-781 (2013).
- Schmitt, N., Bentebibel, S. -. E., Ueno, H. Phenotype and functions of memory Tfh cells in human blood. Trends in Immunology. 35 (9), 436-442 (2014).
- Simpson, N., et al. Expansion of circulating T cells resembling follicular helper T cells is a fixed phenotype that identifies a subset of severe systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism. 62 (1), 234-244 (2010).
- Wang, J., et al. High frequencies of activated B cells and T follicular helper cells are correlated with disease activity in patients with new-onset rheumatoid arthritis. Clinical and Experimental Immunology. 174 (2), 212-220 (2013).
- Ueno, H. Human Circulating T Follicular Helper Cell Subsets in Health and Disease. Journal of Clinical Immunology. 36, 34-39 (2016).
- Maecker Holden, T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Jia, Y., et al. Impaired Function of CD4+ T Follicular Helper (Tfh) Cells Associated with Hepatocellular Carcinoma Progression. PLOS ONE. 10 (2), 0117458 (2015).
- Byford, E. T., Carr, M., Ladikou, E., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Circulating Tfh1 (cTfh1) cell numbers and PD1 expression are elevated in low-grade B-cell non-Hodgkin’s lymphoma and cTfh gene expression is perturbed in marginal zone lymphoma. PLOS ONE. 13 (1), 0190468 (2018).
- Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. Journal of Experimental Medicine. 204 (8), 1849-1861 (2007).
- Duan, Z., et al. Phenotype and function of CXCR5+CD45RA-CD4+ T cells were altered in HBV-related hepatocellular carcinoma and elevated serum CXCL13 predicted better prognosis. Oncotarget. 6 (42), 44239-44253 (2015).
- Zhang, X., et al. Circulating CXCR5+CD4+helper T cells in systemic lupus erythematosus patients share phenotypic properties with germinal center follicular helper T cells and promote antibody production. Lupus. 24 (9), 909-917 (2015).
- Sage, P. T., Francisco, L. M., Carman, C. V., Sharpe, A. H. The receptor PD-1 controls follicular regulatory T cells in the lymph nodes and blood. Nature Immunology. 14 (2), 152-161 (2013).
- Sage, P. T., Alvarez, D., Godec, J., von Andrian, U. H., Sharpe, A. H. Circulating T follicular regulatory and helper cells have memory-like properties. The Journal of Clinical Investigation. 124 (12), 5191-5204 (2014).
- Sage, P. T., Tan, C. L., Freeman, G. J., Haigis, M., Sharpe, A. H. Defective TFH Cell Function and Increased TFR Cells Contribute to Defective Antibody Production in Aging. Cell Reports. 12 (2), 163-171 (2015).
- Yu, N., et al. CD4+CD25+CD127low/- T Cells: A More Specific Treg Population in Human Peripheral Blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1780 (2012).
