수용 체와 효소 간의 기능 상호 작용을 공부에 대 한 분석 결과 Co-immunoprecipitation
Summary
여기, 우리는 공동 immunoprecipitation과 동시에 효소 모집 및 효소 활동에 원형질 막 수용 체의 특정 단백질 도메인의 기여를 연구에 구슬 효소 활동 분석 결과 대 한 프로토콜을 제시.
Abstract
수용 체 관련 된 효소는 세포 활성화의 주요 중재자. 이 효소는 통제, 적어도 부분에서 수용 체의 세포질 꼬리와 물리적 상호 작용을 통해. 종종 상호 작용 특정 단백질 도메인을 통해 발생 하 고 효소의 활성화에 결과. 단백질 사이 상호 작용을 공부 하는 여러 방법이 있다. 공동-immunoprecipitation은 일반적으로 단백질 단백질 상호 작용에 필요한 도메인을 공부 하는 데 사용 됩니다, 있다 아무 분석 문서를 동시에 모집된 효소의 활동에 특정 도메인의 기여. 따라서 여기 설명 하는 방법을 결합 단백질과 관련된 효소 활성화 사이 상호 작용의 동시 평가 구슬 효소 활동 분석 결과 공동 immunoprecipitation. 이 프로토콜의 목표 단백질 및 효소와 효소의 완전 한 활성화에 대 한 의무는 도메인 간의 실제 상호 작용에 대 한 중요 한 도메인을 식별 하는 것입니다. 이 분석 결과의 중요성을 설명, 특정 수용 체로 단백질 도메인에 기여할 효소, 수용 체의 세포질 꼬리의 바인딩 다른 도메인은 동일한 효소의 기능을 조절 하는 데 필요한.
Introduction
촉매 수용 체와 수용 체 티로신 kinases는 막 횡단 단백질에 extracellular ligand의 바인딩 세포내 측면1에 효소 활동을 하면. 다른 kinases와 그들의 세포질 꼬리를 가수분해 등 특정 효소를 모집 하는 동안 일부 수용 체 수용 체 및 효소 기능 보유. 수용 체의 꼬리를이 효소의 촉매 조치는 효소의 채용은 항상 동일한 단백질 도메인2에 의해 통제 되지 않는 두 개의 별도 프로세스. 불행 하 게도, 동시에 상호 작용 및 효소 활동을 평가 하기 위해 특정 도구가 있다. 여기에 설명 된 기능 공동-immunoprecipitation 분석 결과 정품 인증에서 수용 체의 꼬리에는 효소의 채용을 해 부하는 유용한 방법입니다. 이 분석 결과 항 체 코팅 구슬에 의해 태그 수용 체의 immunoprecipitation를 사용합니다. 그 후, 효소 활동 분석 결과 구슬에 서쪽 오 점 분석 수행 됩니다. 이 방법의 전반적인 목표는 단백질 도메인은 수용 체와 효소 (서쪽 오 점 분석에 의해 평가) 간의 상호 작용에 필요한 폭로 이며 도메인 (구슬에 의해 측정 하는 효소의 완전 한 활성화에 대 한 의무 효소 활동 분석 결과)입니다. 그것은 인간의 질병의 병 인에서 그들의 개입으로 인해 수용 체 관련 된 효소의 기능을 별도 공부를 위한 도구를 개발 하는 중요 한. 또한, 추가이 단백질의 행동의 메커니즘을 이해 하는 것은 소설 치료 개입의 디자인을 도울 수 있다.
프로그램 된 죽음-1 (PD-1) T 세포의 표면에는 금지 수용 체 이며, 과도 한 T 세포 응답을 제한 하는 데 필요한. 최근 몇 년 동안에서 안티-PD-1 항 체 여러 악성1,2의 치료에 연루 되었습니다. PD 1 결 찰 확산, 접착, 및 여러 cytokines3,,45의 분 비를 포함 하 여 다양 한 T 세포 기능을 멈출. PD 1은 면역학 시 냅 스, 그것은 T 세포 수용 체 (TCR)7colocalizes T 세포와 항 원 제시 세포6, 사이의 인터페이스를 지역화 됩니다. 그 후,는 티로신 인산 가수분해 효소 SHP2 [Src 상 동 2 (SH2) 도메인 티로신 인산 가수분해 효소 2] PD-1, 인접 복잡 한 TCR 및 그것의 관련 된 키 티로신 잔류물의 dephosphorylation로 이어지는 세포질 꼬리를 모집 신호 분자3,,45,,89. PD 1의 세포질 꼬리 두 티로신 모티프는 immunoreceptor 티로신 근거한 금지 주제 (ITIM), 및 immunoreceptor 티로신 기반 스위치 모티브 (ITSM)10에 포함 되어 있습니다. 두 모티프는 PD 1 결 찰9,10시 phosphorylated는. Mutagenesis 연구 SHP2 PD-1 신호 및 기능에 있는 그의 역할은 분명 ITIM 반대로 모집4ITSM에 대 한 기본 역할을 계시 했다.
SHP2 중 하나는 닫힌 (접혀) 채택, 구조 또는 오픈 (확장), 활성 구조11저해. SHP2 바인딩 또는 활성화 PD 1의 각 꼬리 도메인의 기여는 아직 해명 하지. 이 질문에 대답, 우리는 PD-1와 그것의 활동12의 꼬리에 SHP2의 채용의 병렬 테스트 수 있도록 분석 결과 개발 했다. 우리는 공동-immunoprecipitation와 동시에 상호 작용 및 효소 활동을 테스트 하는 구슬에 인산 가수분해 효소 활동 분석 결과 고용. 이 분석 결과 사용 하 여, 우리는 PD 1의 ITSM PD 1의 ITIM 완벽 하 게 확장 하 고 효소를 활성화 하는 데 필요한 동안 PD-1, 꼬리 SHP2 모집 충분 한지 보여줍니다.
여러 인접 한 도메인 그들의 세포질 꼬리에 있는 많은 수용 체가 있다. 기능 공동-immunoprecipitation 분석 결과 단백질 모집 또는 효소 활성화에 필요한 특정 도메인의 역할을 파악할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
수용 체-효소의 상호 작용은 세포내 시그널링을 위한 중요 한. 많은 효소 SH2 도메인 동일한 수용 체의 꼬리를 장식 phosphorylated tyrosines에 바인딩 통해 수용 체에 채용 됩니다. 그러나, 효소는 종종 닫힌된 비활성 conformations 통합 하며 활성화 다른 도메인의 동일한 수용 체에 의해 중재 될 수 있는 구조적 변경11 . 분석 결과 설명 여기 측정 이러한 상호 작용에 의해 유도 된 활동 뿐 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 NIH 교부 금 1R01AI125640-01 ‘과 류 마티스 연구 재단에 의해 투자 되었다.
Materials
| PBS | Lonza | 17-516F | Phosphate Buffered Saline |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424-R | 1.5 ml |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | Fetal bovine serum |
| Penicillin / Streptomycin | Fisher | BP295950 | |
| DMEM high glucose without L-glutamine | Lonza | BE12-614F | |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | |
| Anti-SHP2 | Santa Cruz | SC-280 | |
| Anti–GFP-agarose | MBL | D153-8 | |
| Anti-GFP | Roche | 118144600 | |
| Anti-Actin | Santa Cruz | SC-1616 | |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| H2O2 | Sigma | 216763 | 30% |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | EDTA-free |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | Modified Laemmli buffer |
| 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Invitrogen | XP04205BOX | 15-well |
| Nitrocellulose membranes | General Electric | 10600004 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Sodium chloride |
| HEPES | Gibco | 15630080 | N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid |
| DTT | Invitrogen | D1532 | Dithiothreitol |
| pNPP | Sigma | 20-106 | p-Nitrophenyl Phosphate |
| NaOH | Sigma | S8045 | Sodium hydroxide |
| BCA | Fisher | 23225 | Bi Cinchoninic Acid assay |
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