Co-immunoprecipitation analyse til at studere funktionel interaktioner mellem receptorer og enzymer
Summary
Vi præsenterer her, en protokol for co-immunoprecipitation og en på perle enzymatisk aktivitet assay samtidig undersøge specifikke protein domæner af plasmamembran receptorer for både enzym rekruttering og enzymaktivitet bidrag.
Abstract
Receptor-associerede enzymer er de store mediatorer af cellulære aktivering. Disse enzymer reguleres, i det mindste i en del, af fysiske interaktion med cytoplasmatisk hale af receptorer. Interaktioner ofte opstår gennem specifikke protein domæner og resultere i aktivering af enzymer. Der er flere metoder til at studere samspillet mellem proteiner. Mens co-immunoprecipitation er almindeligt anvendt til at studere domæner, der er nødvendige for protein-protein interaktioner, er der ingen assays dokumentet bidrag af bestemte domæner til aktiviteten af de rekrutterede enzymer på samme tid. Derfor, metoden beskrevet her kombinerer co-immunoprecipitation og en på perle enzymatisk aktivitet assay for samtidige vurdering af samspillet mellem proteiner og tilknyttede enzymatisk aktivering. Målet med denne protokol er at identificere de domæner, der er kritiske for fysiske samspil mellem et protein og enzym og de domæner, der er obligatorisk for komplet aktivering af enzymet. Betydningen af denne analyse er vist, som visse receptor protein domæner bidrage til binding af enzym til cytoplasmatisk hale af receptoren, mens andre domæner er nødvendigt at regulere funktionen af det samme enzym.
Introduction
Katalytisk receptorer og receptor tyrosin kinaser er transmembrane proteiner, hvor bindingen af en ekstracellulære ligand forårsager enzymatisk aktivitet på den intracellulære side1. Nogle receptorer besidder både receptor og enzymatiske funktioner, mens andre rekruttere specifikke enzymer kinaser og fosfataser til deres cytoplasmatisk hale. Rekruttering af et enzym til den receptor hale og den efterfølgende katalytiske virkning af dette enzym er to separate processer, der ikke altid er underlagt de samme protein domæner2. Desværre er der ingen særlige værktøjer til at vurdere både interaktion og enzymatisk aktivitet samtidigt. Funktionelle co-immunoprecipitation analysen beskrevet her er en nyttig metode til at dissekere ansættelse af et enzym til halen af en receptor fra sin aktivering. Denne analyse udnytter immunoprecipitation af mærket receptorer af antistof-perler. Efterfølgende udføres både en enzymatisk aktivitet assay og western blot analyse på perler. Det overordnede mål med denne metode er at afdække hvilke protein domæner er nødvendige for interaktioner mellem receptorer og enzymer (vurderet af western blot analyse) og hvilke domæner er obligatorisk for komplet aktivering af enzymer (målt på perle enzymatisk aktivitet assay). Det er væsentligt at udvikle værktøjer til at studere de separate funktioner af receptor-associerede enzymer som følge af deres deltagelse i patogenesen af sygdomme hos mennesker. Desuden kan yderligere forståelse virkningsmekanisme af disse proteiner hjælpe design af nye terapeutiske indgreb.
Programmerede død-1 (PD-1) er en hæmmende receptor på overfladen af T-celler og er nødvendigt for at begrænse overdreven T celle svar. I de seneste år, har anti-PD-1 antistoffer været impliceret i behandling af flere maligniteter1,2. PD-1 ligatur tilbageholder mange T-cellefunktioner, herunder spredning, vedhæftning og sekretion af flere cytokiner3,4,5. PD-1 er lokaliseret til de immunologiske synapse, grænsefladen mellem T-celler og antigen-præsenterer celler6, hvor det colocalizes med T-celle-receptor (TCR)7. Efterfølgende, tyrosin phosphatase SHP2 [Src homologi 2 (SH2) domæne, der indeholder tyrosin phosphatase 2] er rekrutteret til den cytoplasmatisk hale af PD-1, fører til dephosphorylation af centrale tyrosin restkoncentrationer i TCR kompleks og dens tilknyttede proksimale signalering molekyler3,4,5,8,9. Den cytoplasmatisk hale af PD-1 indeholder to tyrosin motiver, en immunoreceptor tyrosin-baserede hæmmende motiv (ITIM) og en immunoreceptor tyrosin baseret switch motiv (ITSM)10. Begge motiver er fosforyleret på PD-1 ligatur9,10. Mutagenese undersøgelser har afsløret en primær rolle for ITSM i SHP2 rekruttering, i modsætning til ITIM, hvis rolle i PD-1 signaling og funktion ikke er klar4.
SHP2 vedtager enten en lukket (foldet), hæmmet kropsbygning eller en åben (extended), aktive kropsbygning11. Bidraget fra hver hale domæne af PD-1 til SHP2 bindende eller aktivisering er endnu ikke klarlagt. For at besvare dette spørgsmål, udviklede vi en analyse, der gør det muligt for paralleltest af ansættelse af SHP2 til halen af PD-1 og dens aktivitet12. Vi ansat co-immunoprecipitation og en på perle fosfatase aktivitet assay at teste både interaktion og enzymatisk aktivitet parallelt. Ved hjælp af denne analyse, viser vi, at ITSM PD-1 er tilstrækkelige til at rekruttere SHP2 til halen af PD-1, mens ITIM PD-1 er nødvendigt at udvide og aktivere enzymet.
Der er mange receptorer, der har flere tilstødende domæner i deres cytoplasmatisk hale. Funktionelle co-immunoprecipitation analysen kan afdække bestemte domæner, der er nødvendige for enten protein ansættelse eller enzymatisk aktivering rolle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Receptor-enzym interaktioner er afgørende for intracellulær signalering. Mange enzymer er rekrutteret til receptorer gennem SH2 domæner bindende at fosforyleres tyrosines, at dekorere haler af de samme receptorer. Dog enzymer er ofte foldet ind i lukkede inaktive konformationer, og aktivering kræver en konformationel ændring11 , som kan være medieret af andre domæner af samme receptor. Analysen beskrives her foranstaltninger interaktioner mellem receptorer og enzymer samt aktiviteten induce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette projekt blev finansieret af NIH tilskud 1R01AI125640-01 og reumatologi Research Foundation.
Materials
| PBS | Lonza | 17-516F | Phosphate Buffered Saline |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424-R | 1.5 ml |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | Fetal bovine serum |
| Penicillin / Streptomycin | Fisher | BP295950 | |
| DMEM high glucose without L-glutamine | Lonza | BE12-614F | |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | |
| Anti-SHP2 | Santa Cruz | SC-280 | |
| Anti–GFP-agarose | MBL | D153-8 | |
| Anti-GFP | Roche | 118144600 | |
| Anti-Actin | Santa Cruz | SC-1616 | |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| H2O2 | Sigma | 216763 | 30% |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | EDTA-free |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | Modified Laemmli buffer |
| 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Invitrogen | XP04205BOX | 15-well |
| Nitrocellulose membranes | General Electric | 10600004 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Sodium chloride |
| HEPES | Gibco | 15630080 | N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid |
| DTT | Invitrogen | D1532 | Dithiothreitol |
| pNPP | Sigma | 20-106 | p-Nitrophenyl Phosphate |
| NaOH | Sigma | S8045 | Sodium hydroxide |
| BCA | Fisher | 23225 | Bi Cinchoninic Acid assay |
References
- Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors. Molecular Cancer. 17 (1), (2018).
- Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex. Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).
- Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).
- Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation. The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).
- Patsoukis, N., et al. Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation. Science Signaling. 5 (230), 46 (2012).
- Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).
- Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
- Hui, E., et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).
- Sheppard, K. A., et al. PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta. FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).
- Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).
- Sun, J., et al. Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2. Nature Communications. 4, 2037 (2013).
- Peled, M., et al. Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).
- Jang, S. H., et al. A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage. Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).
- Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains. The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).
- McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
- Shlapatska, L. M., et al. CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A. The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).
