Co Иммунопреципитация Assay для изучения функционального взаимодействия между рецепторами и ферменты
Summary
Здесь мы представляем собой протокол для co иммунопреципитация и ферментативную активность на шарик assay одновременно изучать вклад доменов конкретных протеина плазматической мембраны рецепторов фермента вербовки и активность фермента.
Abstract
Рецептор связанных ферментов являются основными посредниками клеточных активации. Эти ферменты, регулируются, по крайней мере в части, физических взаимодействий с хвостами цитоплазматических рецепторов. Взаимодействия часто происходят через конкретные белка доменов и привести к активации ферментов. Существует несколько методов для изучения взаимодействия белков. В то время как co иммунопреципитация обычно используется для изучения домены, которые требуются для взаимодействий протеин протеина, есть без анализов, этот документ вклад конкретных доменов на активность ферментов, набранных в то же время. Соответственно метод, описанный здесь сочетает в себе co иммунопреципитация и ферментативную активность на шарик assay для одновременной оценки взаимодействия белков и связанные ферментативной активации. Цель настоящего Протокола заключается в идентификации доменов, которые являются критическими для физических взаимодействий между белков и ферментов и домены, которые являются обязательными для полной активации фермента. Продемонстрировал важное значение этот assay, как некоторые рецептор доменов протеина вклад связывание фермента цитоплазматических хвост рецептора, в то время как другие домены необходимо регулировать функции же фермент.
Introduction
Трансмембранные белки, в которых привязка внеклеточных лигандов вызывает ферментативную активность на внутриклеточную сторона1каталитического рецепторов и рецепторов тирозин киназы. Некоторые приемные устройства обладают рецепторов и ферментативные функции, в то время как другие набирать специфических ферментов как киназы и фосфатаз в их цитоплазматических хвосты. Набор фермента рецептор хвост и последующих каталитического действия этого фермента являются два отдельных процессов, которые не всегда регулируются же домены белка2. К сожалению Есть нет конкретных инструментов для оценки взаимодействия и ферментативную активность одновременно. Assay функциональные co иммунопреципитация, описанные здесь является полезным методом вскрыть вербовки фермента к хвосту рецепторов от ее активации. Этот assay иммунопреципитации тегами рецепторов использует антителами бисером. Впоследствии выполняются ферментативную активность пробирного и Западный анализ помаркой на бусины. Общая цель этого метода является выявить, какие домены белка, необходимые для взаимодействия между рецепторами и ферментов (оценены Западный анализ помаркой) и какие домены являются обязательными для полной активации ферментов (измеряется на шарик Ферментативная активность проба). Важно разработать инструменты для изучения отдельных функций рецептор связанных ферментов из-за их участие в патогенезе заболеваний человека. Кроме того дальнейшее понимание механизмов действий этих белков может помочь дизайн роман терапевтических вмешательств.
Запрограммированной смерти-1 (PD-1) является ингибирующее рецепторами на поверхности клеток T и требуется для ограничения чрезмерного Т-клеток ответов. В последние годы антитела анти PD-1 были вовлечены в лечении множественные злокачественные опухоли1,2. PD-1 перешнуровка сдерживает многочисленные функции Т-клеток, включая распространения, адгезии и секрецию несколько цитокинов3,,4–5. PD-1 локализован для иммунологических синапса, интерфейс между Т-клеток и антиген представляющих клеток6, где он colocalizes с Т клеточных рецепторов (TCR)7. Впоследствии, тирозин фосфатазы SHP2 [Src гомологии 2 (Ш2) домена, содержащие тирозин фосфатазы 2] набирается цитоплазматических хвост PD-1, приводит к dephosphorylation остатков ключевых тирозина в рамках комплекса TCR и его связанные проксимальной сигнальные молекулы3,4,5,8,9. Цитоплазматических хвост PD-1 содержит два мотивы тирозин, immunoreceptor на основе тирозин ингибирующее мотив (ITIM) и immunoreceptor тирозин основе переключатель мотив (ITSM)10. Обе мотивы фосфорилированных на PD-1 перешнуровка9,10. Мутагенез исследования показали основную роль для ITSM вербовка, в отличие от ITIM, чья роль в PD-1 сигнализации и функция не ясно SHP24.
SHP2 принимает либо закрытые (сложить), ингибирует конформации или открытой (расширенный), активной конформации11. Вклад каждого домена хвост PD-1 SHP2 привязки или активации пока не выяснены. Чтобы ответить на этот вопрос, мы разработали assay который позволяет параллельно тестирования набор SHP2 к хвосту PD-1 и его деятельность12. Мы использовали co иммунопреципитация и assay активности фосфатазы на шарик для тестирования взаимодействия и ферментативной активности параллельно. С помощью этого анализа, мы покажем, что ITSM PD-1 достаточно набрать SHP2 к хвосту PD-1, в то время как ITIM PD-1 необходимо в полной мере распространить и активировать энзим.
Есть много рецепторов, которые имеют несколько смежных доменов в их цитоплазматических хвосты. Функциональные co иммунопреципитация assay может раскрыть роль определенных доменов, которые необходимы для белка вербовки или ферментативной активации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Рецептор фермента взаимодействия имеют решающее значение для внутриклеточная сигнализация. Многие ферменты набираются через SH2 доменов, привязка к фосфорилированных tyrosines, которые украшают хвосты же рецепторов рецепторы. Однако ферментов часто складывают в закрытых неактивной конфо…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект финансировался NIH грантов 1R01AI125640-01 и ревматологии исследовательский фонд.
Materials
| PBS | Lonza | 17-516F | Phosphate Buffered Saline |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424-R | 1.5 ml |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | Fetal bovine serum |
| Penicillin / Streptomycin | Fisher | BP295950 | |
| DMEM high glucose without L-glutamine | Lonza | BE12-614F | |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | |
| Anti-SHP2 | Santa Cruz | SC-280 | |
| Anti–GFP-agarose | MBL | D153-8 | |
| Anti-GFP | Roche | 118144600 | |
| Anti-Actin | Santa Cruz | SC-1616 | |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| H2O2 | Sigma | 216763 | 30% |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | EDTA-free |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | Modified Laemmli buffer |
| 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Invitrogen | XP04205BOX | 15-well |
| Nitrocellulose membranes | General Electric | 10600004 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Sodium chloride |
| HEPES | Gibco | 15630080 | N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid |
| DTT | Invitrogen | D1532 | Dithiothreitol |
| pNPP | Sigma | 20-106 | p-Nitrophenyl Phosphate |
| NaOH | Sigma | S8045 | Sodium hydroxide |
| BCA | Fisher | 23225 | Bi Cinchoninic Acid assay |
References
- Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors. Molecular Cancer. 17 (1), (2018).
- Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex. Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).
- Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).
- Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation. The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).
- Patsoukis, N., et al. Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation. Science Signaling. 5 (230), 46 (2012).
- Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).
- Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
- Hui, E., et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).
- Sheppard, K. A., et al. PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta. FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).
- Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).
- Sun, J., et al. Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2. Nature Communications. 4, 2037 (2013).
- Peled, M., et al. Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).
- Jang, S. H., et al. A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage. Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).
- Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains. The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).
- McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
- Shlapatska, L. M., et al. CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A. The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).
