반대로 Zika 바이러스 및 내부 관리 유전자 소변, 혈 청, 그리고 모기 샘플에 대 한 분석 결과 전사 루프 중재 하는 등온 증폭 (RT-램프)

요약

이 프로토콜 Zika 바이러스 탐지 또는 반전 녹음 방송 루프 중재 등온 증폭 (RT-램프)에 의해 대상 인간의 소변 및 혈 청 샘플 또는 모기를 제어 하는 효율적이 고 저렴 한 비용 메서드를 제공 합니다. 이 메서드는 RNA 격리는 필요 하지 않습니다 하 고 30 분 이내 할 수 있습니다.

초록

그러나 Zika 바이러스 (ZIKV) 감염 성인 무 증상 일 수 있다,, 임신 중 감염 유산 및 심각한 신경 기형이 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표 신속 하 게 모두 인간과 모기 샘플에서 ZIKV를 검색 하는 것입니다. ZIKV 검출에 대 한 현재 금 표준 이다 양이 많은 반전 녹음 방송 PCR (qRT-PCR); 반전 녹음 방송 루프 중재 등온 증폭 (RT-램프)은 보다 효율적이 고 저렴 한 비용 테스트 고가의 장비에 대 한 필요 없이 수 있습니다. 본이 연구에서는 실시간 램프 첫 샘플에서 RNA를 분리 하지 않고 ZIKV 검출 다양 한 생물 학적 샘플 30 분 이내에 사용 됩니다. 이 기술은 ZIKV를 사용 하 여 환자 소변 및 혈 청, 감염 및 감염 모기 샘플 시연입니다. 18S ribosomal ribonucleic 산과 말라 각각 인간과 모기 샘플에서 컨트롤로 사용 됩니다.

서론

2015 년, Zika 바이러스 (ZIKV) 주목 저명한 글로벌 관심사의 전염 성 질환으로 임신 중에 감염 유산, 사 산, microcephaly, 뿐만 아니라 다른 선 천 성 신경 심각한 출생 결함에 연결 했다 때문에 출생 결함¹. 드문 경우에, ZIKV Guillain-바레 증후군과 연결 되었습니다. ZIKV는 주로 Aedes 모기;로 전송 그러나, 그것은 또한 성적 접촉¹통해 확산 하실 수 있습니다. ZIKV 감염 대부분의 사람에서 무 증상 또는 다른 arborviruses¹의 감염의 증상과 겹치는 가벼운 감기 같은 증상으로 선물 한다, 그의 신속 하 고 비용 효율적인 검색을 위한 향상 된 방법 필요가 했다 사람 뿐만 아니라 현지 모기 인구를 화면에 ZIKV.

양이 많은 반전 녹음 방송 PCR (qRT-PCR)은 ZIKV 감지;에 대 한 신뢰성 분석 결과 그러나,이 기술은 고가의 특수 장비, 숙련 된 직원, 그리고 관심의 샘플에서 RNA 격리 해야합니다. 반전 녹음 방송 루프 중재 등온 증폭 (RT-램프)는만 가닥으로 thermophilic DNA 중 합 효소의 사용으로 인 한 부 화 온도 필요....

프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 버몬트 건강의 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인 되었습니다. 모든 실험 관련 지침 및 규정에 따라 수행 했다.

주의: 잠재적으로 전염 하는 모든 자료는 개인 보호 장비의 사용을 포함 하는 Biosafety 수준 2 기준에 따라 처리 되어야 합니다. 에 어로 졸을 생산 있습니다 어떤 절차 biosafety 내각에서 수행 되어야 합니다. 또한, 라이브 모기 사용 적절 한 절지동물 포함 수준 1-3 시설에서 수행 되어야 합니다. 선 천 성 이상에 ZIKV 감염의 협회를 감안할 때, 여성은 임신, 임신 하려고 또는이 여자의 파트너 크게 최소화 해야 ZIKV에 그들의 실험실 노출 합니다. ZIKV 샘플의 카테고리 B 생물학 물질에 따라 학과의 교통 위험 물질 규정으로 미국에서 분류 된다 (49 CFR 부 171-180)을 준수 해야 합니다 따라서 샘플 배송 지침입니다. 미국의 ZIKV biospecimens로 가져오기는 센터를 질병 통제 및 예방 (CDC) 가져오기 허용 필요 하다. ZIKV 전송 위한 벡터 그들이 감염 되는 경우에 필요는 미국 농 무부 (USDA)으로 역할을 수 있는 모든 절지동물의 수입을 허용 합니다. 이 정보는 현재 간행물의 때에. 최신 추천 https://www.cdc.gov/zika/lab....

결과

RT-램프 반응 3 가지 방법을 사용 하 여 분석할 수 있습니다. 첫째, 형광 핵 산 염료의 추가 함께 긍정적인 반응이 됩니다 노란색/녹색 색상에 부정적인 반응을 오렌지 육안으로 색상에 나타납니다. 둘째, RT 램프 반응 형광 핵 산 염료의 추가에 결과 형광 신호 샘플 UV 빛에 의해 흥분. 부정적인 반응을 소량 부정적인 컨트롤에 있을 수 있는 모든 배경 형광에 감지 형광 신호를 없을 것 이다. 마지막으로, RT-램프 반응은 agarose 젤에 밖으로 실행할 수 있습니다. 반면 부정적인 반응 없는 DNA 악대 있을 것 이다 긍정적인 RT 램프 반응 밴딩 패턴, 있을 것 이다. 이러한 분석 방법의 모든 3를 사용 하 여이의 예는 그림 2 와 3에서 설명 했다. 이 샘플의 RNA RT 램프 이전 절연 했다. 그림 1 실시간 램프 반응에 사.......

토론

ZIKV RT-램프 분석 결과 인간과 모기 샘플⁶을 사용 하 여이 종이 작품에 설명 된. 탐지의 한계는 약 1 게놈에 해당⁶, 증상 ZIKV 감염 환자의 일반적인 바이러스 부하 이기 때문에 10 충분 해야³  10⁶ PFU/mL⁷. 또한,이 방법은 ZIKV 샘플 먼저 분리 RNA와 세포 배양에서 바이러스 증폭 없이 검색할 수 있습니다. 이 크게 시간, 비용, 및 qRT-PCR에 비해이 분석 결과의 건강 위험을 감소 합니다.

이 프로토콜에 표시 된 볼륨 비율에 사용 하는 소변 샘플 RNA 격리 없이 RT 램프 반응을 허용 해야 한다. 하나 이론적으로 실시간 램프 반응에 사용 하는 샘플의 양을 증가 수, 하는 동안 때이 샘플은 소변 치료 운동 해야. 소변은 PCR 반응;을 억제할 수 있는 여러 화학.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Bst 2.0 WarmStart DNA 중합효소	New England Biolabs	M0537S
등온 증폭 버퍼	New England Biolabs	B0537S
WarmStart RTx 역전사효소	New England Biolabs	M0380S
남극 열불안정 UDG	New England Biolabs	M0372S
MgSO4	New England Biolabs	B1003S
100mM dATP 솔루션	New England Biolabs	N0440S	데옥시뉴클레오티드 세트 N0446S
100 mM dCTP 용액	New England Biolabs	N0441S	데옥시뉴클레오티드 세트 N0446S
100 mM dTTP 용액	New England Biolabs	N0443S	데옥시뉴클레오티드 세트 N0446S
100 mM dGTP 용액	New England Biolabs	N0442S	데옥시뉴클레오티드 세트 N0446S
100 mM dUTP 용액	Thermo Fisher Scientific	R0133
SYBR Green I 핵산 겔 염색	Invitrogen	S7563
Nancy-520	Sigma Aldrich	01494
Low DNA Mass Ladder	Invitrogen	10-068-013
Zika Postive Control	Robert Koch Institute, Germany	N/A
Agarose	Thermo Fisher Scientific	BP1600
BlueJuice Gel Loading Buffer	Invitrogen
프라이머	통합 DNA 기술	맞춤형 올리고
뉴클레아제 프리 워터	앰비온	AM9938
소변 방부제	Norgen Biotek	18126
ZIKV PCR 표준	로버트 코흐 연구소	N/A	베로 E6 세포 상등액
DENV2 뉴기니 C 제어	코네티컷 농업 실험 스테이션	N/A

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