I Vivo Avbildning av reaktive oksygen arter i et murint sår modell
Summary
Vi beskriver en ikke-invasiv i vivo imaging som er effektiv og kostnadseffektiv, bruker L-012, en chemiluminescent luminol-analog, visualisere og kvantifisere reaktive oksygen arter (ROS) generert i en mus excisional sår modell.
Abstract
Generering av reaktive oksygen arter (ROS) er et kjennetegn på inflammatoriske prosesser, men i overkant, oksidativt stress er mye involvert i ulike patologi som kreft, åreforkalkning og diabetes. Vi har tidligere vist at dysfunksjon av den kjernefysiske faktoren (erythroid-avledet 2)-som 2 (Nrf2) / Kelch-like erythroid cellen-avledet protein 1 (Keap1) signalering sti fører til ekstrem ROS ubalanse under kutan sårtilheling i diabetes. Siden ROS nivåer er en viktig indikator for utviklingen av sårheling, er spesifikk og nøyaktig kvantifisering teknikker verdifull. Flere i vitro analyser måle ROS i celler og vev har blitt beskrevet; men gir de bare et enkelt kumulative mål per prøve. Flere nylig, har utviklingen av protein-basert indikatorer og tenkelig modaliteter tillatt for unike spatiotemporal analyser. L-012 (C13H8ClN4NaO2) er en luminol som kan brukes både i vivo og i vitro chemiluminescent påvisning av ROS generert av NAPDH oksidase. L-012 avgir et sterkere signal enn andre fluorescerende sonder og har vist seg å være både sensitiv og pålitelig for å oppdage ROS. Tid forfalle anvendelse av L-012-tilrettelagt imaging gir verdifull informasjon om inflammatoriske prosesser samtidig redusere behovet for offer og reduserer samlede studie dyr. Her beskriver vi en protokoll utnytte L-012-tilrettelagt i vivo for å kvantifisere oksidativt stress i en modell av excisional sårheling diabetiker mus med lokalt dysfunksjonelle Nrf2/Keap1.
Introduction
Oksygen metabolitter generert gjennom inflammatoriske prosesser bidra til ulike signalnettverk cascades samt destruktive endring av cellulære komponenter1. Utnytte følsom og spesifikke teknikker for å måle ROS er avgjørende for å studere inflammatoriske prosesser og karakterisere effekten av oksidativt stress. I vivo imaging er verdifullt på grunn av sin evne til å levere dynamisk romlige og tidsmessige data i levende vev. L-012 er en syntetisk chemiluminescent sonde som er svært følsom for superoxide anioner og produserer høyere lav intensitet enn andre fluorescerende sonder i celler og vev fullblod1,2,3, 4. det har vært vellykket ansatt i vivo imaging i murine modeller å studere flere inflammatoriske sykdommer, inkludert leddgikt og kolitt5,6. Det har ennå å være ansatt i en etablert kutan sårheling modell. Måling av ROS generert er like relevant å vurdere utviklingen av sårheling under ulike forhold. Den sensitivitet og noninvasive natur denne metoden gjør det en lovende teknikk for å studere sårheling over murine modeller.
Nrf2 er en viktig drivkraft av antioksidant respons og en transcriptional faktor med spesifisitet for antioksidant svar element (er) felles for regionene arrangøren av flere antioksidant enzymer8. I fravær av oksidativt stress, er Nrf2 sequestered i cytoplasma av Keap1, som senere fører til sin ubiquitination og fornedrelse. Ubalanse i Nrf2/Keap1 veien har vært innblandet i upassende redoks homeostasis og forsinket sårheling i innstillingen for økt oksidativt stress9. Vi har tidligere vist at undertrykkelse av Keap1 stimulerer økt Nrf2 aktivitet og fremmer redning av patologisk kutan sårheling i diabetiker sår9.
Her beskriver vi en protokoll som benytter L-012-assistert bioluminescens for å måle ROS nivåer i en excisional kutan sår helbredelse modell, som er avgjørende for å markere tilknytningen mellom ROS og sår helbredelse. Denne teknikken viser sanntid endringer i oksidativt byrden sår og umiddelbar periferi. Videre, denne metoden tillater rask vurdering av tiltak og mekanismer som påvirker redoks håndtering. Her bruker vi en modell av Keap1 knockdown for restaurering av redoks homeostase evaluere anvendelsen av vår strategi. Fordi våre teknikken er ikke-invasiv og sår er uforstyrret, benyttes samme dyret for videre bekreftende analyser basert på histology eller celle lysates.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vanlige teknikker for måling av ROS har vært begrenset av komplekse protokoller som krever vev utvinning eller tilsvarende invasiv teknikker. De siste årene, har målinger av oksidativt stress blitt rapportert på grunnlag av nyskapende tenkelig modaliteter, og dermed muliggjør spatiotemporal vurderinger9,10,11. L-012 har flere fordeler som en chemiluminescent sonde i forhold til luminol, lucigenin og MCLA1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige til prekliniske Imaging kjernen ved NYU School of Medicine, med spesiell takk til Orlando Aristizabal og Youssef Zaim Wadghiri. Kjernen er en delt ressurs støttes delvis av Laura og Isaac Perlmutter Cancer Center støtte Grant NIH/NCI 5P30CA016087 og NIBIB biomedisinsk Technology Resource Center Grant NIH P41 EB017183. Dette arbeidet ble støttet av American Diabetes Association “Sti å stoppe Diabetes” til DC [bevilgning nummer 1-16-ACE-08] og NYU anvendt forskning støtte fondet til PR
Materials
| BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratories | 000642 | |
| 13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm) | Sigma Aldrich | 665581 | |
| 3M Tegaderm Transparent Film Dressings | 3M | 88-1626W | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668027 | |
| Keap1 Stealth siRNA | Thermofisher Scientific | 1299001 | |
| Silencer negative control | Thermofisher Scientific | AM4635 | |
| Opti-MEM Reduced Serum | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| Methyl-cellulose | Sigma Aldrich | 9004-67-5 | |
| L-012 | Wako Chemicals | 120-04891 | |
| IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System | PerkinElmer |
References
- Nishinaka, Y., et al. A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).
- Daiber, A., et al. Measurement of NAD(P)H oxidase-derived superoxide with the luminol analogue L-012. Free Radical Biology and Medicine. 36 (1), 101-111 (2004).
- Imada, I., et al. Analysis of reactive oxygen species generated by neutrophils using a chemiluminescence probe L-012. Analytical Biochemistry. 271 (1), 53-58 (1999).
- Sohn, H. Y., Gloe, T., Keller, M., Schoenafinger, K., Pohl, U. Sensitive superoxide detection in vascular cells by the new chemiluminescence dye L-012. Journal of Vascular Research. 36 (6), 456-464 (1999).
- Fuchs, K., et al. In vivo Hypoxia PET Imaging Quantifies the Severity of Arthritic Joint Inflammation in Line with Overexpression of Hypoxia-Inducible Factor and Enhanced Reactive Oxygen Species Generation. The Journal of Nuclear Medicine. 58 (5), 853-860 (2017).
- Asghar, M. N., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in murine colitis. Inflammatory Bowel Diseases. 20 (8), 1435-1447 (2014).
- Galiano, R. D., Michaels, J. t., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair and Regeneration. 12 (4), 485-492 (2004).
- Soares, M. A., et al. Restoration of Nrf2 Signaling Normalizes the Regenerative Niche. Diabetes. 65 (3), 633-646 (2016).
- Wang, X., et al. Imaging ROS signaling in cells and animals. Journal of Molecular Medicine. 91 (8), 917-927 (2013).
- Kielland, A., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radical Biology and Medicine. 47 (6), 760-766 (2009).
- Balke, J., et al. Visualizing Oxidative Cellular Stress Induced by Nanoparticles in the Subcytotoxic Range Using Fluorescence Lifetime Imaging. Small. , (2018).
- Zielonka, J., Lambeth, J. D., Kalyanaraman, B. On the use of L-012, a luminol-based chemiluminescent probe, for detecting superoxide and identifying inhibitors of NADPH oxidase: a reevaluation. Free Radical Biology and Medicine. 65, 1310-1314 (2013).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signalling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Rabbani, P. S., et al. Targeted Nrf2 activation therapy with RTA 408 enhances regenerative capacity of diabetic wounds. Diabetes Research and Clinical Practice. 139, 11-23 (2018).
- Rabbani, P. S., et al. Novel lipoproteoplex delivers Keap1 siRNA based gene therapy to accelerate diabetic wound healing. Biomaterials. 132, 1-15 (2017).
