In Vivo Billeddannelse af reaktive ilt arter i en Murine sår Model
Summary
Vi beskriver en non-invasiv i vivo billeddannelse protokol, der er strømlinede og omkostningseffektive, udnytte L-012, en kemiluminescens luminol-analog, for at visualisere og kvantificere reaktive ilt arter (ROS) genereret i en excisional sår musemodel.
Abstract
Generation af reaktive ilt arter (ROS) er kendetegnende for inflammatoriske processer, men overskydende, oxidativ stress er bredt involveret i forskellige patologier såsom kræft, åreforkalkning og diabetes. Vi har tidligere vist at dysfunktion af den nukleare faktor (erythroid-afledte 2)-lignende 2 (Nrf2) / Kelch-lignende erythroid celle-afledte protein 1 (Keap1) signalering vej fører til ekstreme ROS ubalance under kutane sårheling i diabetes. Da ROS niveauer er en vigtig indikator for progression af sårheling, er specifikke og nøjagtig kvantificering teknikker værdifulde. Flere in vitro- assays til at måle ROS i celler og væv er blevet beskrevet; de giver dog kun en enkelt kumulativ måling pr. prøve. Mere nylig, udviklingen af protein-baserede indikatorer og billeddiagnostiske modaliteter har tilladt for enestående spatiotemporelle analyser. L-012 (C13H8ClN4NaO2) er en luminol derivat, der kan bruges til både in vivo og in vitro- kemiluminescens påvisning af ROS genereret af NAPDH oxidase. L-012 udsender et stærkere signal end andre fluorescerende sonder og har vist sig at være både følsomme og pålidelige til påvisning af ROS. Tid bortfalder anvendeligheden af L-012-faciliteret imaging giver værdifulde oplysninger om inflammatoriske processer samtidig at reducere behovet for offer og samlet antal undersøgelse dyr. Her, beskriver vi en protokol udnytte L-012-lettet i vivo imaging for at kvantificere oxidativt stress i en model af excisional sårheling ved hjælp af diabetiske mus med lokalt dysfunktionelle Nrf2/Keap1.
Introduction
Oxygen metabolitter genereret gennem inflammatoriske processer bidrage til forskellige signaling cascades samt destruktive ændring af cellulære komponenter1. Udnytte følsomme og specifikke teknikker til at måle ROS er kritisk for at studere inflammatoriske processer og kendetegner virkningerne af oxidativt stress. In vivo billeddannelse er værdifulde på grund af dens evne til at levere dynamisk rumlige og tidsmæssige data i levende væv. L-012 er et syntetisk kemiluminescens sonde, der er meget følsomme for superoxid anioner og producerer en højere lysintensitet end andre fluorescerende sonder i celler, væv og blod1,2,3, 4. det har med held været ansat i i vivo billeddannelse i murine modeller til at studere adskillige inflammatoriske sygdomme, herunder arthritis, og colitis5,6. Det har endnu at være ansat i en etableret kutane sårheling model. Måling af ROS genereret er lige så relevant at vurdere udviklingen af sårheling under forskellige betingelser. Følsomhed og noninvasive karakteren af denne metode gør det en lovende teknik til at studere sårheling på tværs af murine modeller.
Nrf2 er en vigtig drivkraft for antioxidant respons og en transcriptional faktor med specificitet for den antioxidant svar element (er) fælles for regionerne promotor af flere antioxidant enzymer8. I mangel af oxidativt stress, er Nrf2 afsondret i cytoplasma af Keap1, som efterfølgende forårsager sin ubiquitination og nedbrydning. Ubalance i Nrf2/Keap1 vej har været impliceret i upassende redox homøostase og Forsinket sårheling i fastsættelsen af øget oxidativ stress9. Vi har tidligere vist, at undertrykkelse af Keap1 stimulerer øget Nrf2 aktivitet og fremmer redning af patologiske kutane sårheling i diabetisk sår9.
Her beskriver vi en protokol, der udnytter L-012-assisteret bioluminescens imaging for at måle ROS niveauer i en excisional kutant sår healing model, som er kritiske for fremhævning tilknytningen mellem ROS og sårheling. Denne teknik viser real-time ændringer i oxidative byrde inden for sår og umiddelbar periferien. Desuden, denne metode giver mulighed for hurtig vurdering af interventioner og mekanismer at påvirke redox håndtering. Her bruger vi en model af Keap1 knockdown genskabelse af redox homøostase for at vurdere anvendeligheden af vores strategi. Fordi vores teknik er non-invasiv og sår er uforstyrret, kan det samme dyr som bruges til yderligere konfirmatoriske analyser på grundlag af histologi eller celle lysates.
Protocol
Representative Results
Discussion
Almindelige teknikker til måling af ROS har været begrænset af komplekse protokoller som kræver væv udvinding eller tilsvarende invasive teknikker. I de seneste år, er blevet rapporteret målinger af oxidativt stress på grundlag af innovative billeddiagnostiske modaliteter, hvorved spatiotemporelle vurderinger9,10,11. L-012 har flere fordele som en kemiluminescens sonde i forhold til luminol, lucigenin og MCLA<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for de prækliniske Imaging Core på NYU-School of Medicine, med en særlig tak til Orlando Aristizabal og Youssef Zaïm Wadghiri. Kernen er en delt ressource delvist understøttet af Laura og Isaac Perlmutter Cancer Center støtte Grant NIH/NCI 5P30CA016087 og NIBIB biomedicinsk teknologi ressource Center Grant NIH P41 EB017183. Dette arbejde blev støttet af American Diabetes Association “Vej til at stoppe Diabetes” D.C. [grant nummer 1-16-ACE-08] og NYU anvendt støtte forskningsfonden til P.R.
Materials
| BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratories | 000642 | |
| 13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm) | Sigma Aldrich | 665581 | |
| 3M Tegaderm Transparent Film Dressings | 3M | 88-1626W | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668027 | |
| Keap1 Stealth siRNA | Thermofisher Scientific | 1299001 | |
| Silencer negative control | Thermofisher Scientific | AM4635 | |
| Opti-MEM Reduced Serum | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| Methyl-cellulose | Sigma Aldrich | 9004-67-5 | |
| L-012 | Wako Chemicals | 120-04891 | |
| IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System | PerkinElmer |
References
- Nishinaka, Y., et al. A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).
- Daiber, A., et al. Measurement of NAD(P)H oxidase-derived superoxide with the luminol analogue L-012. Free Radical Biology and Medicine. 36 (1), 101-111 (2004).
- Imada, I., et al. Analysis of reactive oxygen species generated by neutrophils using a chemiluminescence probe L-012. Analytical Biochemistry. 271 (1), 53-58 (1999).
- Sohn, H. Y., Gloe, T., Keller, M., Schoenafinger, K., Pohl, U. Sensitive superoxide detection in vascular cells by the new chemiluminescence dye L-012. Journal of Vascular Research. 36 (6), 456-464 (1999).
- Fuchs, K., et al. In vivo Hypoxia PET Imaging Quantifies the Severity of Arthritic Joint Inflammation in Line with Overexpression of Hypoxia-Inducible Factor and Enhanced Reactive Oxygen Species Generation. The Journal of Nuclear Medicine. 58 (5), 853-860 (2017).
- Asghar, M. N., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in murine colitis. Inflammatory Bowel Diseases. 20 (8), 1435-1447 (2014).
- Galiano, R. D., Michaels, J. t., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair and Regeneration. 12 (4), 485-492 (2004).
- Soares, M. A., et al. Restoration of Nrf2 Signaling Normalizes the Regenerative Niche. Diabetes. 65 (3), 633-646 (2016).
- Wang, X., et al. Imaging ROS signaling in cells and animals. Journal of Molecular Medicine. 91 (8), 917-927 (2013).
- Kielland, A., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radical Biology and Medicine. 47 (6), 760-766 (2009).
- Balke, J., et al. Visualizing Oxidative Cellular Stress Induced by Nanoparticles in the Subcytotoxic Range Using Fluorescence Lifetime Imaging. Small. , (2018).
- Zielonka, J., Lambeth, J. D., Kalyanaraman, B. On the use of L-012, a luminol-based chemiluminescent probe, for detecting superoxide and identifying inhibitors of NADPH oxidase: a reevaluation. Free Radical Biology and Medicine. 65, 1310-1314 (2013).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signalling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Rabbani, P. S., et al. Targeted Nrf2 activation therapy with RTA 408 enhances regenerative capacity of diabetic wounds. Diabetes Research and Clinical Practice. 139, 11-23 (2018).
- Rabbani, P. S., et al. Novel lipoproteoplex delivers Keap1 siRNA based gene therapy to accelerate diabetic wound healing. Biomaterials. 132, 1-15 (2017).
