In Vivo Bildgebung von reaktiven Sauerstoffspezies in einem Murine Wunde Modell
Summary
Wir beschreiben eine nicht-invasive in Vivo imaging-Protokoll, das schlanke und kostengünstige, Verwendung von L-012, eine Chemolumineszenz Luminol-Analog, zu visualisieren und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erzielte eine excisional Wunde Mausmodell zu quantifizieren.
Abstract
Die Generation von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) ist ein Markenzeichen von entzündlichen Prozessen, aber im Übermaß, oxidativer Stress ist weit verbreitet in verschiedenen Krankheiten wie Krebs, Arteriosklerose und Diabetes beteiligt. Wir haben zuvor gezeigt, dass Dysfunktion des nuklearen Faktors (2 erythroiden abgeleitet)-wie 2 (Nrf2) / Kelch-ähnliche erythroiden Zelle abgeleitete Protein 1 (Keap-1) Signalisierung Weg führt zu extremen ROS Ungleichgewicht bei kutanen Wundheilung bei Diabetes. Da ROS Ebenen ein wichtiger Indikator für den Verlauf sind der Wundheilung, sind spezifische und genaue Quantifizierung Techniken wertvoll. Mehrere in-vitro- Tests, ROS in Zellen und Geweben zu messen sind beschrieben worden; Sie liefern jedoch nur eine kumulative Einzelmessung pro Probe. Vor kurzem haben die Entwicklung von Protein-basierten Indikatoren und bildgebender Verfahren für einzigartige räumlich-zeitliche Analysen erlaubt. L-012 (C13H8ClN4NaO2) ist ein Luminol-Derivat, das für in Vivo und in Vitro Chemolumineszenz verwendet werden kann Erkennung von ROS von NAPDH Oxidase generiert. L-012 strahlt ein stärkeres Signal als andere fluoreszierenden Sonden und hat gezeigt, dass sowohl empfindlich und zuverlässig für die Erkennung von ROS. Die Zeit verfallen Anwendbarkeit des L-012-erleichtert Imaging liefert wertvolle Informationen über entzündliche Prozesse reduzieren die Notwendigkeit für Opfer und insgesamt senken die Zahl der Studie Tiere. Hier beschreiben wir ein Protokoll, die Verwendung von L-012-erleichtert, in Vivo imaging um zu oxidativen Stress in einem Modell der excisional Wundheilung mit diabetischen Mäusen mit lokal dysfunktionalen Nrf2/Keap1 zu quantifizieren.
Introduction
Sauerstoff-Metabolite erzeugt durch entzündliche Prozesse tragen zu verschiedenen Signalisierung Kaskaden sowie destruktiven Änderung der zellulären Komponenten1. Sensitiver und spezifischer Techniken zur Messung der ROS ist entscheidend für entzündliche Prozesse zu studieren und zu charakterisieren die Effekte von oxidativem Stress. In-Vivo Bildgebung ist wertvoll wegen seiner Fähigkeit, dynamische räumliche und zeitliche Angaben im lebenden Gewebe. L-012 ist eine synthetische Chemilumineszenz-Sonde, die ist sehr empfindlich für Superoxid-Anionen und erzeugt eine höhere Lichtintensität als andere fluoreszierenden Sonden in Zellen, Geweben und Vollblut1,2,3, 4. es hat mehrere entzündliche Erkrankungen, wie Arthritis und Kolitis5,6studieren erfolgreich für die in-Vivo Bildgebung in murinen Modellen eingesetzt. Es ist noch nicht in einer etablierten kutanen Wundheilung Modell eingesetzt werden. Messung von ROS erzeugt ist ebenso relevant für den Verlauf der Wundheilung unter verschiedenen Bedingungen zu bewerten. Die Empfindlichkeit und die nicht-invasive Natur dieser Methode macht es eine vielversprechende Technik für Wundheilung in murinen Modellen zu studieren.
Nrf2 ist eine wichtige Triebfeder der antioxidativen Reaktion und ein transcriptional Faktor mit Spezifität für die Antioxidant Response-Element (sind) für den Projektträger Regionen mehrere antioxidative Enzyme8. In Ermangelung von oxidativem Stress ist Nrf2 im Zytoplasma von Keap1, abgesondert, wodurch anschließend seine Ubiquitination und Abbau. Ungleichgewicht des Nrf2/Keap1-Signalwegs hat in ungeeigneten Redox-Homöostase und verzögerte Wundheilung in der Umgebung von erhöhtem oxidativen Stress9verwickelt. Wir haben bereits gezeigt, dass die Unterdrückung der Keap1 erhöhten Nrf2-Aktivität anregt und fördert Rettung der pathologischen kutanen Wundheilung in diabetischen Wunden9.
Hier beschreiben wir eine Protokoll, die nutzt L-012-gestützte Biolumineszenz imaging um zu ROS Ebenen in einem excisional kutanen Wunde heilende Modell zu messen, die kritisch für die Hervorhebung der Assoziation zwischen ROS und Wundheilung ist. Diese Technik zeigt Änderungen in Echtzeit oxidativen Belastung innerhalb von Wunden und unmittelbaren Peripherie. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode zur schnellen Beurteilung der Interventionen und Mechanismen dieser Affekt Redox Handhabung. Hier verwenden wir ein Modell des Keap1 Zuschlag für die Wiederherstellung des Redox-Homöostase, um die Anwendbarkeit unserer Strategie zu bewerten. Da unsere Technik nicht-invasiv ist und Wunden ungestört sind, kann das gleiche Tier für weitere bestätigende Analysen auf der Grundlage der Histologie oder Zelle Lysates verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gängige Techniken zur Messung von ROS haben durch komplexe Protokolle erfordern Gewebe Extraktion oder ähnlich invasive Techniken beschränkt wurde. In den letzten Jahren wurden Messungen von oxidativem Stress auf der Grundlage innovativer bildgebender Verfahren, wodurch für räumlich-zeitliche Einschätzungen9,10,11beschrieben. L-012 hat mehrere Vorteile als Chemilumineszenz Sonde relativ Luminol, Lucigenin und MCLA<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar für die präklinische Imaging Core an der New York University School of Medicine, mit besonderem Dank an Orlando Aristizabal und Youssef Zaim Wadghiri. Der Kern ist eine gemeinsam genutzte Ressource, teilweise unterstützt von Laura und Isaac Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH/NCI 5P30CA016087 und NIBIB Biomedizinische Technologie Resource Center Grant NIH P41 EB017183. Diese Arbeit wurde unterstützt von der American Diabetes Association “Weg zu stoppen Diabetes” D.C. [Grant-Nummer 1-16-ACE-08] und NYU angewendet Unterstützung Forschungsfonds, P.R.
Materials
| BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratories | 000642 | |
| 13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm) | Sigma Aldrich | 665581 | |
| 3M Tegaderm Transparent Film Dressings | 3M | 88-1626W | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668027 | |
| Keap1 Stealth siRNA | Thermofisher Scientific | 1299001 | |
| Silencer negative control | Thermofisher Scientific | AM4635 | |
| Opti-MEM Reduced Serum | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| Methyl-cellulose | Sigma Aldrich | 9004-67-5 | |
| L-012 | Wako Chemicals | 120-04891 | |
| IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System | PerkinElmer |
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