在这里, 我们提出了一个方案来筛选细胞外蛋白微阵列, 以识别新的受体配体相互作用在高通量。我们还描述了一种利用蛋白质微珠复合物来增强瞬态蛋白相互作用的检测方法。
分泌因子、膜相连受体及其相互作用的伙伴是细胞通信的主要调节器, 并在稳态和疾病期间启动信号级联, 因此是主要的治疗靶点。尽管这些互动网络具有相关性, 但在现有数据库中的代表性仍然严重不足;因此, 大多数细胞外蛋白没有记录的结合伙伴。这种差异主要是由于与细胞外蛋白的研究相关的挑战, 包括功能蛋白的表达, 以及细胞表面受体之间经常建立的弱、低亲和力、蛋白质相互作用。这种方法的目的是描述打印细胞外蛋白库的微阵列格式, 以筛选蛋白质-蛋白质相互作用。为了能够检测弱相互作用, 描述了一种基于查询蛋白多化的方法。结合这种基于微珠的多聚化方法, 提高多价, 蛋白质微阵列允许在高吞吐量下对瞬态蛋白-蛋白质相互作用进行可靠的检测。这种方法提供了一种快速和低样本的方法, 用于识别适用于任何细胞外蛋白的新相互作用。介绍了蛋白质微阵列的制备和筛选方案。这项技术将有助于研究人员寻求一种可靠的方法来发现细胞外空间中的蛋白质相互作用。
本文回顾的方法描述了以微阵列格式打印细胞外蛋白的方法, 然后是针对该库筛选感兴趣的目标的方法。我们已经确定蛋白质多化是检测以低结合亲和力为特征的相互作用的关键一步。为了加强对这些相互作用的检测, 我们描述了一种基于使用微珠对感兴趣的查询蛋白进行多聚合的协议。
分泌和细胞表面表达的蛋白质 (统称为细胞外蛋白) 及其相互作用的伙伴是细胞通信、信号传递和与微环境相互作用的关键调节剂。因此, 它们对于调节许多生理和病理过程至关重要。大约四分之一的人类基因组 (5, 000 蛋白质) 编码细胞外蛋白, 鉴于其对系统交付药物的重要性和可获得性, 是药物开发的关键目标1。因此, 细胞外蛋白占市场上已知的药物药理作用的蛋白质靶点的70% 以上, 被称为 “可吸毒蛋白质组”。尽管细胞外蛋白-蛋白质相互作用 (eppi) 网络的重要性和丰富性, 但在现有数据库中的代表性仍然明显不足。这从根本上说是由于细胞外蛋白的复杂生化性质, 从而使其无法使用最可用的技术进行表征2。首先, 膜蛋白很难溶解, 这一过程通常涉及苛刻的洗涤条件和洗涤剂;其次, 细胞外蛋白往往缺乏相关的翻译后修饰, 如糖基化, 当这些蛋白质表达在常用的异源系统中时, 糖基化是不存在的。最后, 受体之间的相互作用, 如在免疫细胞上表达的共同受体, 往往是短暂的, 并具有非常低的亲和力 (kd 在~ 1μm 到 & gt;100 μm 范围) 的特点。总之, 这些蛋白质的性质及其结合伙伴提供了最广泛使用的技术, 如亲和力净化/质谱 (ap/ms) 或酵母-双杂交, 不适合检测细胞外空间中的相互作用2,(三)有什么问题吗?
为了克服这些技术挑战, 加速发现细胞外蛋白的新相互作用, 我们开发了一个高覆盖率的细胞外蛋白微阵列 4,5。微阵列具有用少量样品生成高密度表面的优势, 通常适合进行高吞吐量研究。基于蛋白质微阵列的研究先前为几种模型生物的蛋白质相互作用提供了相关的见解, 尽管主要集中在细胞质相互作用或特定的蛋白质家族6,7, 8。相反, 利用这项技术研究细胞外蛋白相互作用的工作有限。我们开发了一种蛋白质微阵列方法, 通过构建一个全面和高度多样化的纯化分泌蛋白和单个跨膜 (stm) 受体库, 将其作为重组细胞外域 (ecd) 融合, 从而能够对 eppi 进行研究。常见的亲和纯化标签 4。蛋白质微阵列屏幕的成功在很大程度上取决于高质量蛋白质库的建立。对于培养蛋白和查询蛋白的表达, 优先选择哺乳动物细胞或昆虫细胞作为异源表达系统, 以确保正确添加翻译后修饰, 如糖基化或二硫化键。sds-page、尺寸排除色谱和多角度激光散射是评估重组蛋白质量的常用技术。然后, 蛋白质库被发现在环氧硅烷幻灯片上, 并存储在-20°c, 供长期使用。下面所述的协议建议蛋白质浓度超过 0.4 mgml。因此, 低表达的蛋白质可能需要在样品打印和储存之前采取浓缩步骤。然而, 这种技术的一个主要优点是所需的蛋白质体积小 (50 微克的蛋白质足以执行和 gt;2,000 屏幕), 同时只需极少的查询蛋白消耗 (每个重复屏幕20-25 微克)。使用此处描述的协议和设备, 并在库可用的情况下, 可以在一个工作日内生成单个查询蛋白的结果。
检测细胞外环境中蛋白质相互作用的一个主要挑战来自于它们的典型弱或瞬态性质, 这使得最常用的方法无法识别。提高结合亲和力大大提高了检测弱蛋白相互作用的灵敏度9,10, 11.基于这一原理, 我们开发了一种使用蛋白质 a 包覆珠子 4,5对查询蛋白 (表示为 fc 融合) 进行多聚化的方法。为了避免任何潜在的失活查询蛋白的随机标记, 我们改为标记一个不相关的人类免疫球蛋白 g 与 cy5, 并将其与查询蛋白一起添加到蛋白质 a 珠子, 从而消除任何伪影, 由于直接共轭的染料的蛋白质的利益。考虑到几个共受体对的微孔亲和力, 与筛选为可溶性蛋白的 fc 融合查询蛋白相比, 多价复合物大大提高了信噪比 4.
总之, 该协议的目标是描述微阵列幻灯片的制备, 其中包含预先存在的细胞外蛋白库, 用于识别受体配体相互作用。我们回顾了幻灯片打印的步骤, 然后是一个针对细胞外蛋白库筛选感兴趣的蛋白质的协议。此外, 我们还介绍了一种基于微珠的增强 eppi 检测方法, 以提高所研究的蛋白质的亲和力。这里描述的细胞外蛋白微阵列技术为筛选和检测低假阳性比的新型 eppi 提供了一种快速、可靠和有效的方法, 并且仅利用了查询蛋白的微克量。调查。这项技术推动了多项研究, 这些研究为以前未知的细胞功能和各种受体的信号通路提供了相关的见解, 包括病毒免疫调节剂14,可以用来去孤儿任何细胞外蛋白质的利益。
大量的孤立受体仍然存在于人类基因组中, 新的相互作用的伙伴继续出现的细胞外蛋白与以前的特征配体。定义人类和模型生物中的受体配体相互作用对于了解在稳态过程中决定细胞通信的机制以及导致疾病的失调至关重要, 因此为新的或改进的机制提供信息治疗方案。然而, 广泛使用的技术检测细胞外蛋白相互作用是一个重要的障碍, 主要原因是与细胞受体及其相互作用伙伴的生物化学相关的技?…
The authors have nothing to disclose.
我们感谢菲拉默·卡尔和神户圆对手稿的批判性阅读。我们感谢任志刚提供的优秀技术咨询。
Ultra Pure MB Grade glycerol | USB Corporation | 56-81-5 | Protein storage |
SeptoMark blocking buffer | Zeptosens | BB1, 90-40 | Blocking buffer microarray slides |
Bovine serum albumin | Roche | 03-117-957-001 | Slide control for mask fitting (optional) |
Polypropylene multiwell plates | Greiner Bio One | 82050-678 | Protein storage |
Polypropylene multiwell plates | Arrayit | MMP384 | Slide printing |
NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Arrayit | NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Slide printing |
Micro spotting pins | Arrayit | Micro spotting pins | Slide printing |
ZeptoFOG blocking station | Zeptosens | ZeptoFOG blocking station, 1210 | Block slides after printing |
Skim milk powder | Thermo Fisher | LP0031 | Blocking solution |
Epoxysilane-coated glass slide | Nextrion Slide E | 1064016 | Microarray slides |
Glass holder and slide rack set | Wheaton | 900303 | Slide storage |
Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA23031 | Albumin labeling |
Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | Human IgG labeling |
Pro-spin desalting column | Princeton Separations | CS-800 | Remove free dye |
Adhesive aluminum foil seal | AlumaSeal | F-384-100 | Seal stock plates |
Polypropylene cryogenic vials | Corning | 430658 | Master vials for protein library storage |
Protein A microbeads | Miltenyi | 120-000-396 | Query protein multimerization |
Human IgG | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Irrelevant IgG for labeling |
Protein A | Sigma | P7837 | Microarray slide blocking |
Hybridization station, a-Hyb or similar | Miltenyi | Hybridization station, a-Hyb or similar | Automated microarray processing (optional) |
GenePix 4000B scanner or similar | Molecular Devices | GenePix 4000B scanner or similar | Slide scanning |
GenePix Pro or equivalent data extraction software | Molecular Devices | GenePix Pro or equivalent data extraction software | Data processing |
Signal P4.1 | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites |
TMHMM 2.0 server | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction of transmembrane helices in proteins |
Phobius | Stockholm Bioinformatics Center | online software | A combined transmembrane topology and signal peptide predictor |
TOPCONS | Stockholm University | online software | Prediction of membrane topology and signal peptides |