Technologie des microréseaux protéine extracellulaire pour détection haut débit des Interactions Ligand-récepteur de faible affinité
Summary
Nous présentons ici un protocole à l’écran une protéine extracellulaire microarrays pour l’identification des interactions ligand-récepteur roman en haut débit. On décrit également une méthode pour améliorer la détection des interactions protéine-protéine transitoires en utilisant des complexes protéine-faisant.
Abstract
Facteurs sécrétés, attaché à la membrane des récepteurs et leurs partenaires d’interactions sont les principaux régulateurs de la communication cellulaire et l’initiation des cascades de signalisation au cours de l’homéostasie et la maladie et ainsi représentent des cibles thérapeutiques. Malgré leur pertinence, ces réseaux d’interactions reste nettement sous-représentées dans des bases de données courantes ; par conséquent, plus les protéines extracellulaires n’ont aucun partenaire de liaison documentée. Cet écart est principalement en raison de relever les défis associés à l’étude des protéines extracellulaires, notamment de l’expression des protéines fonctionnelles et l’affinité faible, faible, interactions protéine souvent établies entre les récepteurs de surface cellulaire. Le but de cette méthode consiste à décrire l’impression d’une bibliothèque de protéines extracellulaires dans un format « microarray » pour le dépistage des interactions protéine-protéine. Pour activer la détection des interactions faibles, on décrit une méthode basée sur la multimerization de la protéine de requête à l’étude. Couplé à cette approche axée sur les faisant multimerization de MULTIVALENCE accrue, le microarray de protéine permet une détection robuste d’interactions protéine-protéine transitoire en haut débit. Cette méthode offre une échantillon rapide et faible consommation-approche pour l’identification de nouvelles interactions applicables à n’importe quelle protéine extracellulaire. Impression de microarray de protéine et le protocole de dépistage sont décrits. Cette technologie sera utile pour les chercheurs qui cherchent une méthode robuste à la découverte des interactions de protéine dans l’espace extracellulaire.
Introduction
La méthode examinée ici décrit l’impression d’une collection de protéines extracellulaires dans un format « microarray », suivie d’une méthode de dépistage d’une cible d’intérêt contre cette bibliothèque. Nous avons identifié des protéines multimerization comme une étape cruciale pour la détection des interactions caractérisées par affinités de liaison faible. Pour améliorer la détection de ces interactions, les auteurs décrivent un protocole basé sur multimerization de la protéine de requête d’intérêt à l’aide de microbilles.
Sécrétée et cell surface protéines exprimées (collectivement appelées protéines extracellulaires) ainsi que leurs partenaires d’interactions sont des régulateurs clés de communication cellulaire, la signalisation et l’interaction avec le microenvironnement. Ils sont, par conséquent, essentiels dans la régulation de nombreux processus physiologiques et pathologiques. Environ un quart du génome humain (≈5, 000 protéines) codant pour des protéines extracellulaires, qui, compte tenu de leur importance et leur accessibilité aux médicaments systématiquement livrées, représentent des cibles clés pour drogues développement1. En conséquence, les protéines extracellulaires représentent plus de 70 % des cibles protéiques avec action pharmacologique connue pour des médicaments homologués sur le marché, connu comme le « proteome thérapeutiques ». Malgré leur importance et leur abondance, les réseaux d’interaction (ePPI) extracellulaire protéines restent remarquablement sous-représentées dans les bases de données disponibles. Il s’agit fondamentalement en raison de la complexité biochimique des protéines extracellulaires, qui s’oppose à leur caractérisation à l’aide de technologies plus disponible2. Tout d’abord, les protéines membranaires sont difficiles à solubiliser, un processus qui comporte souvent des conditions de lavage dure et détergents ; Deuxièmement, protéines extracellulaires manquent souvent des modifications post-traductionnelles telles que glycosylation qui sont absents lorsque ces protéines sont exprimées en couramment utilisées systèmes hétérologues. Enfin, les interactions entre les récepteurs comme corécepteurs exprimées sur les cellules immunitaires, sont souvent transitoires et caractérisé par une très faible affinité (KD dans le ~ 1 μM à > 100 gamme μM). Au total, la nature de ces protéines et leur liaison partenaires rendent plus largement utilisé des technologies, telles que l’affinité purification/spectrométrie de masse (AP/MS) ou levure-double-hybride, impropre à la détection des interactions dans l’espace extracellulaire 2 , 3.
Dans le but de relever ces défis techniques et d’accélérer la découverte de nouvelles interactions des protéines extracellulaires, nous avons développé une couverture élevée protéines extracellulaires microarray4,5. Microarrays offrent l’avantage de générer des surfaces à haute densité avec de petites quantités d’échantillon et généralement se prêtent à des études de haut débit. Études de puces de protéine fournis précédemment pertinentes aperçus des interactions de protéine pour plusieurs organismes modèles, quoique se concentrant principalement sur les interactions cytosoliques ou protéine spécifique familles6,7, 8. En revanche, travail limité a été fait pour étudier les interactions de protéine extracellulaire à l’aide de cette technologie. Nous avons développé une méthode de microarray de protéine pour permettre des études d’ePPIs en construisant une bibliothèque complète et diversifiée de protéines sécrétées purifiées et unique transmembranaire (STM) récepteurs exprimés comme recombinants domaines extracellulaires (DPE), fusionnées à balises communes pour affinité purification4. Le succès des écrans microarray protéine dépend fortement de la mise en place d’une bibliothèque de protéine de haute qualité. Pour l’expression de la protéine de la bibliothèque et la requête, les cellules de mammifères ou des cellules d’insecte préférentiellement apparaissaient comme des systèmes d’expression hétérologue, afin d’assurer le bon ajout de modifications post-traductionnelles telles que liaisons disulfure de glycosylation. SDS-PAGE, chromatographie d’exclusion et de diffusion de la lumière laser multi-angle sont des techniques couramment utilisées pour évaluer la qualité des protéines recombinantes. La bibliothèque de la protéine est ensuite repérée sur des diapositives epoxysilane et conservée à-20 ° C pour une utilisation à long terme. Les concentrations de protéine au-dessus de 0,4 mg/mL sont recommandées pour le protocole décrit ci-dessous. Par conséquent, faible exprimant des protéines peuvent exiger une étape de concentration avant l’impression de l’échantillon et le stockage. Néanmoins, un principal avantage de cette technique est le faible volume de protéine nécessaire (50 μg de protéines est suffisante pour exécuter > 2 000 écrans), aux côtés de la consommation de protéines de requête minimale (20 à 25 μg par écran de doublons). Utilisant le protocole et les équipements décrits ici, et autant de bibliothèques sont disponibles, des résultats pour les protéines de requêtes individuelles peuvent être générés un jour ouvrable.
Un défi majeur dans la détection des interactions de protéine dans l’environnement extracellulaire découle de leur caractère typiquement faible ou transitoire, qui s’oppose à une identification par des méthodologies plus couramment utilisés. Accroître l’avidité de liaison grandement améliore la sensibilité pour la détection des protéines faibles interactions9,10,11. Basé sur ce principe que nous avons développé une méthode pour multimerize les protéines de la requête (exprimées en fusion Fc) à l’aide de protéine A-enduit perles4,5. Pour éviter toute éventuelle inactivation de la protéine de la requête par marquage aléatoire, nous plutôt étiqueter une immunoglobuline humaine hors de propos G avec Cy5 et ajoutez-le ainsi que de la protéine de requête pour les billes de protéine A, éliminant ainsi tous les artefacts en raison de la conjugaison directe d’un teindre à la protéine d’intérêt. Étant donné les affinités micromolaires de plusieurs paires de corécepteur, les complexes multivalents augmentent considérablement le rapport signal sur bruit, par rapport aux protéines de requête Fc-fusion projetés en protéines solubles4.
En résumé, le but du présent protocole est de décrire la préparation de lames microarray contenant une bibliothèque de protéines extracellulaires préexistant pour l’identification des interactions de récepteur-ligand. Nous passons en revue les étapes de la diapositive, impression, suivi d’un protocole de dépistage d’une protéine d’intérêt à la bibliothèque de protéines extracellulaires. De plus, on décrit une méthode pour la détection améliorée d’ePPIs issu des microbilles pour atteindre une avidité accrue de la protéine étudiée. La technologie de microarray de protéine extracellulaire décrite ici représente une approche rapide, robuste et efficace pour le dépistage et détection ePPI roman avec faible de faux positifs et en utilisant seulement microgramme par quantités de la protéine de la requête en vertu de enquête. Cette technologie a alimenté de nombreuses études qui ont fourni des renseignements pertinents sur jusque-là inconnues des fonctions cellulaires et voies de signalisation pour une variété de récepteurs12,13, dont14d’immunoregulators virale, et peut être utilisé pour désactiver orphanize toute protéine extracellulaire d’intérêt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un nombre important de récepteurs orphelins demeure dans le génome humain, et nouveaux partenaires interdépendants continuent d’émerger des protéines extracellulaires avec des ligands précédemment caractérisées. Définir les interactions de récepteur-ligand dans l’homme et les organismes modèles est essentielle pour comprendre les mécanismes qui régissent la communication cellulaire lors de l’homéostasie, comme dérèglement conduisant à la maladie et par conséquent informer nouveaux ou améliorés …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Philamer Calses et Kobe Yuen pour la lecture critique du manuscrit. Nous sommes reconnaissants à Randy yens pour les excellents conseils techniques.
Materials
| Ultra Pure MB Grade glycerol | USB Corporation | 56-81-5 | Protein storage |
| SeptoMark blocking buffer | Zeptosens | BB1, 90-40 | Blocking buffer microarray slides |
| Bovine serum albumin | Roche | 03-117-957-001 | Slide control for mask fitting (optional) |
| Polypropylene multiwell plates | Greiner Bio One | 82050-678 | Protein storage |
| Polypropylene multiwell plates | Arrayit | MMP384 | Slide printing |
| NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Arrayit | NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Slide printing |
| Micro spotting pins | Arrayit | Micro spotting pins | Slide printing |
| ZeptoFOG blocking station | Zeptosens | ZeptoFOG blocking station, 1210 | Block slides after printing |
| Skim milk powder | Thermo Fisher | LP0031 | Blocking solution |
| Epoxysilane-coated glass slide | Nextrion Slide E | 1064016 | Microarray slides |
| Glass holder and slide rack set | Wheaton | 900303 | Slide storage |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA23031 | Albumin labeling |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | Human IgG labeling |
| Pro-spin desalting column | Princeton Separations | CS-800 | Remove free dye |
| Adhesive aluminum foil seal | AlumaSeal | F-384-100 | Seal stock plates |
| Polypropylene cryogenic vials | Corning | 430658 | Master vials for protein library storage |
| Protein A microbeads | Miltenyi | 120-000-396 | Query protein multimerization |
| Human IgG | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Irrelevant IgG for labeling |
| Protein A | Sigma | P7837 | Microarray slide blocking |
| Hybridization station, a-Hyb or similar | Miltenyi | Hybridization station, a-Hyb or similar | Automated microarray processing (optional) |
| GenePix 4000B scanner or similar | Molecular Devices | GenePix 4000B scanner or similar | Slide scanning |
| GenePix Pro or equivalent data extraction software | Molecular Devices | GenePix Pro or equivalent data extraction software | Data processing |
| Signal P4.1 | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites |
| TMHMM 2.0 server | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction of transmembrane helices in proteins |
| Phobius | Stockholm Bioinformatics Center | online software | A combined transmembrane topology and signal peptide predictor |
| TOPCONS | Stockholm University | online software | Prediction of membrane topology and signal peptides |
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