低親和性受容体-リガンド相互作用のハイスループット検出の細胞外タンパク質マイクロ アレイ技術
Summary
高スループットで新規受容体-リガンド相互作用の同定のため画面細胞外蛋白質のマイクロ アレイのプロトコルを紹介します。タンパク質マイクロ ビーズの複合体を使用して、一時的なタンパク質-タンパク質相互作用の検出を強化する方法について述べる。
Abstract
分泌因子、つなが膜の受容体と相互作用する相手は携帯電話通信の主なレギュレータと恒常性と病の間にカスケードをシグナル伝達の開始など治療の主な対象を表します。その妥当性にもかかわらずこれらの相互作用のネットワーク現在データベースで著しく過小評価のまましたがって、最も細胞外タンパク質が、文書化された結合パートナーを持っていることはないです。この不一致は主に機能性タンパク質と弱い、低親和性蛋白質の相互作用の細胞表面受容体の間が確立の表情など、細胞外のタンパク質の研究に関連する課題。このメソッドの目的は、細胞外蛋白質蛋白質蛋白質の相互作用のスクリーニングのためのマイクロ アレイ フォーマットのライブラリの印刷を記述することです。弱い相互作用の検出を有効にするには、調査の下でクエリ タンパク質の多量体形成に基づく方法が説明されています。増加 multivalency のこのビーズ ベースの多量体形成のアプローチに結合、蛋白質のマイクロ アレイは、高スループットの一時的なタンパク質-タンパク質相互作用の検出をことができます。この手法アプローチを提供迅速かつ低サンプル消費-細胞外蛋白質を適用可能な新しい相互作用を識別するため。蛋白質のマイクロ アレイの印刷とスクリーニング プロトコルを説明します。この技術は、細胞外空間におけるタンパク質相互作用の検出のための堅牢なメソッドを求めて捜査の役に立つでしょう。
Introduction
ここを見直してメソッドでは、このライブラリに対して関心の対象のスクリーニングの試みに続いて、マイクロ アレイ フォーマットの細胞外蛋白質のコレクションの印刷について説明します。低結合親和性によって特徴付けられる相互作用の検出のための重要なステップとしてタンパク質の多量体形成を同定しました。これらの相互作用の検出を高めるためには、マイクロ ビーズを使用して興味のクエリ タンパク質の多量体形成に基づくプロトコルについて述べる。
分泌され、細胞表面発現タンパク質 (総称して細胞外蛋白質と呼ばれる) その相互作用パートナーと一緒に、細胞間コミュニケーション、シグナリングと、微小環境との相互作用の主調整装置。彼らは、したがって、多くの生理学的および病理学的プロセスの調節に不可欠であります。人間のゲノム (≈5、000 の蛋白質) のおよそ四分の一を細胞外蛋白質のためエンコード、薬品開発1主要なターゲットを表す体系的に提供された薬の意義とアクセシビリティを考えると。その結果、細胞外蛋白質は「druggable プロテオーム」として知られている、市場で承認された薬の既知の薬理作用を持つ蛋白質ターゲットの 70% 以上を表します。にもかかわらず、その重要性と豊かさ、細胞外のタンパク質-タンパク質相互作用 (ePPI) ネットワーク利用可能なデータベースで著しく過小評価のまま。これは根本的に利用可能なほとんどの技術2を使用してその特性を排除する細胞外蛋白質の複雑な生化学的性質のためです。まず、膜タンパク質は、過酷な洗浄の条件と洗剤; をしばしば含むプロセスの可溶化困難第二に、細胞外蛋白質は、不在のこれらの蛋白質の表現は、一般的には、糖鎖修飾異種システムに使用されるなど、関連する翻訳後修飾をしばしば欠いています。最後に、免疫細胞に発現共受容体などの受容体間の相互作用は、しばしば一時的なと非常に低い親和性によって特徴付けられる (〜 1 μ M ~ KD > 100 μ M の範囲)。完全に、これらの蛋白質と最も広くパートナーをレンダリングの自然利用アフィニティ精製/質量分析法 (AP/ミリ秒) または細胞外空間における相互作用の検出には不向き酵母-2-ハイブリッドなどの技術2,3。
これらの技術的課題を克服するため、細胞外蛋白質の小説の相互作用の発見を加速するために、我々 は高いカバレッジの細胞外タンパク質マイクロ アレイ4,5を開発しました。マイクロ アレイ、高スループット研究に一般に従うサンプルの少量の高密度サーフェスの生成の利点を提供します。ゾル性細胞質の相互作用または特定の蛋白質家族6,7、中心とはいえタンパク質マイクロ アレイを用いた研究がいくつかのモデル有機体の蛋白質の相互作用に関連する洞察力を提供している以前 8。対照的に、限られた仕事は、この技術を使って細胞外蛋白質の相互作用を調査するため行われています。単一膜貫通 (STM) 受容器表現に融合として遺伝子組換え細胞外ドメイン (ECD) と浄化された分泌蛋白質の包括的で非常に多様なライブラリを構築することで ePPIs の研究蛋白質マイクロ アレイ法を開発しました。アフィニティ精製4共通のタグ。蛋白質のマイクロ アレイのスクリーンの成功は、高品質タンパク質ライブラリの確立に大きく依存します。ライブラリとクエリの両方のタンパク質の発現、哺乳動物細胞や昆虫細胞優先的に選ばれた異種発現システムとして適切な添加糖またはジスルフィド結合などの翻訳後修飾を確保するため。SDS ページとサイズ排除クロマトグラフィー多角度レーザ光散乱は、組換え蛋白質の品質を評価するためによく利用されている手法です。タンパク質ライブラリは、エポキシシランのスライドに斑点を付けるし、長期使用のための-20 ° C で保存します。0.4 mg/ml を超えるタンパク質濃度は、以下のプロトコルに適しています。したがって、低発現タンパク質は、濃度ステップ前にサンプル印刷とストレージを必要があります。それにもかかわらず、この手法の主な利点は、必要なタンパク質の少量 (50 μ g のタンパク質が実行するための十分な > 2,000 画面)、最小限のクエリ蛋白質の消費量 (重複画面あたり 20 25 μ g) と一緒に。プロトコルおよび装置を使用して、ここで説明し、1 営業日以内蛋白質個々 のクエリの結果を生成できるライブラリが使用可能で、提供されます。
細胞外の環境の蛋白質の相互作用を検出するに主要な課題は、最も一般的に使用される方法論によって識別を排除、その特質上弱いまたは非定常自然から発生します。結合親和が大きく増えて弱いタンパク質相互作用9,10,11の検出感度を向上させます。(Fc 融合として表される) クエリ蛋白質 multimerize する手法を開発した原理に基づく蛋白質 A をコートしたビーズ4,5を使用しています。クエリ タンパク質の任意の潜在的な不活性化を避けるためには、ランダムなラベリング、我々 代わりに Cy5 と無関係な人間グロブリン G にラベルを付けるし、クエリ タンパク質と一緒にに追加タンパク質 A ビーズの直接接合のための成果物がなくなり、興味の蛋白質を染めます。いくつかの受容体ペアのマイクロモル親和性を考えると、非常に多価の錯体は信号対雑音比、可溶性タンパク質4として上映 Fc 融合クエリ蛋白質と比較してを高めます。
要約すると、このプロトコルの目標は受容体-リガンド相互作用の同定の既存の細胞外タンパク質ライブラリを含むマイクロ アレイ スライドの準備を記述するためです。スライド印刷、その後細胞外タンパク質ライブラリに対する興味の蛋白質のスクリーニングのためのプロトコルにするための手順を確認します。さらに、研究中のタンパク質の増加の親和を達成するためにマイクロ ビーズに基づく ePPIs の強化された検出法について述べる.ここで説明細胞外蛋白質のマイクロ アレイの技術は唯一蛋白質のマイクログラム量、クエリの下を用いてスクリーニングおよび低い偽陽性率と新規 ePPI を検出するための高速、堅牢で効率的なアプローチを表します調査。この技術は、各種受容体12,13, を含むウイルス immunoregulators14、未知の細胞機能やシグナル伝達経路に関連する洞察力を提供している複数の研究を煽っています。デ orphanize 興味の任意の細胞外蛋白質に利用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
人間のゲノムでは、オーファン受容体のかなりの数が残っているし、以前特徴付けられる配位子を細胞外蛋白質のために出現し続ける小説の相互作用のパートナー。ディクテーション中不全疾患につながるだけでなく、恒常性は、携帯電話通信のメカニズムを理解し、したがって新しいまたは強化された機能を知らせる重要な人間の受容体-リガンド相互作用やモデル生物の定義は治療オプシ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
原稿を批判的に読み、Philamer Calses と神戸ユンに感謝します。ランディ円優れた技術的なアドバイスに感謝しております。
Materials
| Ultra Pure MB Grade glycerol | USB Corporation | 56-81-5 | Protein storage |
| SeptoMark blocking buffer | Zeptosens | BB1, 90-40 | Blocking buffer microarray slides |
| Bovine serum albumin | Roche | 03-117-957-001 | Slide control for mask fitting (optional) |
| Polypropylene multiwell plates | Greiner Bio One | 82050-678 | Protein storage |
| Polypropylene multiwell plates | Arrayit | MMP384 | Slide printing |
| NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Arrayit | NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Slide printing |
| Micro spotting pins | Arrayit | Micro spotting pins | Slide printing |
| ZeptoFOG blocking station | Zeptosens | ZeptoFOG blocking station, 1210 | Block slides after printing |
| Skim milk powder | Thermo Fisher | LP0031 | Blocking solution |
| Epoxysilane-coated glass slide | Nextrion Slide E | 1064016 | Microarray slides |
| Glass holder and slide rack set | Wheaton | 900303 | Slide storage |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA23031 | Albumin labeling |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | Human IgG labeling |
| Pro-spin desalting column | Princeton Separations | CS-800 | Remove free dye |
| Adhesive aluminum foil seal | AlumaSeal | F-384-100 | Seal stock plates |
| Polypropylene cryogenic vials | Corning | 430658 | Master vials for protein library storage |
| Protein A microbeads | Miltenyi | 120-000-396 | Query protein multimerization |
| Human IgG | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Irrelevant IgG for labeling |
| Protein A | Sigma | P7837 | Microarray slide blocking |
| Hybridization station, a-Hyb or similar | Miltenyi | Hybridization station, a-Hyb or similar | Automated microarray processing (optional) |
| GenePix 4000B scanner or similar | Molecular Devices | GenePix 4000B scanner or similar | Slide scanning |
| GenePix Pro or equivalent data extraction software | Molecular Devices | GenePix Pro or equivalent data extraction software | Data processing |
| Signal P4.1 | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites |
| TMHMM 2.0 server | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction of transmembrane helices in proteins |
| Phobius | Stockholm Bioinformatics Center | online software | A combined transmembrane topology and signal peptide predictor |
| TOPCONS | Stockholm University | online software | Prediction of membrane topology and signal peptides |
References
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