Внеклеточный протеин технология Microarray для высокой пропускной способности обнаружения низкого сродства рецептор лиганд взаимодействий
Summary
Здесь мы представляем протокол для экрана внеклеточный протеин microarrays для идентификации Роман рецептор лиганд взаимодействий в высокой пропускной способности. Мы также описывают метод для улучшения обнаружения переходных белок белковых взаимодействий с помощью белка microbead комплексов.
Abstract
Выделяется факторы, мембрана привязанный рецепторов и их взаимодействия партнеров являются основными регуляторами сотовой связи и начало сигнальные каскады во время гомеостаза и болезней и как таковые представляют собой премьер терапевтических целей. Несмотря на их актуальности эти сети взаимодействия по-прежнему значительно недопредставлены в текущих базах данных; Таким образом наиболее внеклеточных белков у партнера не документированы привязки. Это расхождение обусловлено прежде всего проблемы, связанные с изучением внеклеточных белков, включая выражение функциональных белков и слабый, низкий сродство, взаимодействий протеина, часто создаваемых между поверхности рецепторы клеток. Этот метод предназначен для описания печать библиотеки внеклеточных белков в формате microarray для скрининга белок белковых взаимодействий. Чтобы включить обнаружение слабых взаимодействий, описан метод, основанный на multimerization белка запроса под исследование. Связан этот подход на основе microbead multimerization для увеличения поливалентность, microarray протеина позволяет надежного обнаружения переходных белок белковых взаимодействий в высокой пропускной способности. Этот метод предлагает пример быстрого и низкого потребления подход для идентификации новых взаимодействий, применимым к любой внеклеточных белков. Описаны протеина microarray печати и скрининга протокол. Эта технология будет полезным для следователей, ищущих надежный метод для обнаружения белковых взаимодействий в внеклеточного пространства.
Introduction
Метод, рассмотрели здесь описывает печать коллекции внеклеточных белков в формате microarray дна, а затем с помощью метода для проверки целевого интерес против этой библиотеки. Мы выявили белок multimerization как решающий шаг для обнаружения взаимодействий, характеризуются низкой привязки сродства. Для улучшения обнаружения этих взаимодействий, мы описываем протокол, основанный на multimerization запроса протеина интереса, используя микрошарики.
Выделяется и клеток выражена поверхности белки (собирательно именуются внеклеточные белки) наряду с их взаимодействия партнеров являются ключевые регуляторы сотовой связи, сигнализации и взаимодействия с микроокружения. Таким образом, они имеют важное значение в регуляции многих физиологических и патологических процессов. Около четверти генома человека (≈5, 000 белки) кодирует внеклеточных белков, который, учитывая их важность и доступность для систематически поставляемых наркотиков, представляют собой ключевые цели развития наркотиков1. Следовательно внеклеточные белки представляют более чем 70% белковых мишеней с известных фармакологических действий для утвержденных лекарств на рынке, известный как «druggable протеом». Несмотря на их важность и изобилия внеклеточный протеин взаимодействия (ePPI) сетей по-прежнему удивительно недопредставлены в доступных баз данных. Это принципиально ввиду сложных биохимических внеклеточных белков, который исключает их характеристик с помощью самых доступных технологий2. Во-первых мембранные белки трудны для того солюбилизировать последнего, процесс, который часто включает в себя тяжелые Стиральная условий и моющих средств; Во-вторых внеклеточные белки часто не хватает соответствующих столб-поступательные изменения таких как гликозилирования, отсутствуют когда эти белки выражаются в часто используемые гетерологичных систем. Наконец, взаимодействие между рецепторов, таких как сопредседатель рецепторов, выраженные на иммунные клетки, часто переходных и характеризуется очень низкой работоспособностью (D K в ~ 1 мкм для > 100 мкм диапазон). В общей сложности характер этих белков и их привязки, которые партнеры оказывают наиболее широко используемых технологий, таких как сродства очищения/масс-спектрометрии (AP/МС) или дрожжи 2 гибрида, непригодных для обнаружения взаимодействий в пространстве внеклеточного 2 , 3.
В попытке преодолеть эти технические проблемы и ускорить открытие новых взаимодействий для внеклеточных белков мы разработали высокий охват внеклеточный протеин microarray дна4,5. Microarrays предлагают преимущество создания высокой плотности поверхности с небольшим количеством образца и обычно поддаются исследования высокой пропускной способности. Исследования на основе microarray протеина ранее предоставили соответствующие понимание взаимодействия протеина для нескольких модельных организмов, хотя главным образом на цитозольной взаимодействия или на конкретных белка семьи6,7, 8. В отличие от ограниченных была проделана расследовать внеклеточный протеин взаимодействия с использованием этой технологии. Мы разработали метод microarray протеина для включения исследований ePPIs путем создания всеобъемлющего и весьма разнообразных библиотека очищенного секретируемые белки и одного трансмембранные рецепторы (СТМ) выражена как рекомбинантной внеклеточных доменов (ECD) сливается с общие теги для очищения сродства4. Успех на экранах microarray протеина опирается на создание высокого качества белка библиотеки. Для выражения запроса, так и библиотека белка mammalian клетки или клетки, насекомых преференциально были выбраны как гетерологичных выражение системы, для обеспечения правильного сложения столб-поступательные изменения таких облигаций гликозилирования или дисульфида. SDS-PAGE, размер гель-проникающей хроматографии и мульти-угол лазерного рассеяния света являются методы обычно используются для оценки качества рекомбинантных белков. Белка библиотека затем увидел на epoxysilane слайды и температуре-20 ° C для долгосрочного использования. Концентрация белка выше 0,4 мг/мл рекомендуются для протокола, описанных ниже. Таким образом низкий выражая белков может потребовать концентрации шаг до печати выборки и хранения. Тем не менее, основным преимуществом этого метода является небольшой объем белка требуется (50 мкг белка достаточно выполнить > 2000 экраны), наряду с минимальным запроса потребление белка (20-25 мкг за дубликаты экран). С использованием протокола и оборудования описано здесь, и если имеются библиотеки, результаты для отдельных запросов белки могут быть получены в течение одного рабочего дня.
Одной из основных задач при выявлении взаимодействий протеина в внеклеточных среды вытекает из их характерно слабое или временный характер, что исключает возможность идентификации, наиболее часто используемых методологий. Расширения привязки алчность значительно улучшает чувствительность для обнаружения слабых белковых взаимодействий9,10,11. Основываясь на этом принципе, мы разработали метод multimerize запроса белки (выражается как ФК fusion) с помощью белка A-покрытием бусины4,5. Чтобы избежать любой потенциальной инактивации белка запроса путем случайных маркировки, мы вместо этого метка не значения человеческого иммуноглобулина G с Cy5 и добавить его вместе с запроса белка белка А бусы, таким образом устраняя любые артефакты из-за прямого сопряжения краситель для протеина интереса. С учетом всех сходство несколько пар ко-рецептор, разносторонним комплексы значительно повысить соотношение сигнал-шум, по сравнению с Fc фьюжн запросов белки показан как растворимые белки4.
Таким образом цель настоящего Протокола является описать подготовку microarray слайды, содержащий существующие библиотеки внеклеточный протеин для идентификации рецептор лиганд взаимодействий. Мы рассмотрим шаги, необходимые для печати, а затем протокол для скрининга протеина интереса против внеклеточных белков библиотеки слайдов. Кроме того мы описываем метод расширения обнаружения ePPIs на основании микрошарики для достижения увеличения алчность белка изучается. Описанная здесь технология microarray внеклеточный протеин представляет собой быстрый, надежный и эффективный подход для скрининга и выявления роман ePPI с низким коэффициентом ложно положительных и, используя только микрограмм количеств белка запроса под расследование. Эта технология подпитывается несколько исследований, которые предоставили соответствующие взглянуть на ранее неизвестных клеточных функций и сигнальных путей для различных рецепторов12,13, включая вирусный immunoregulators14, и может быть использован для снятия orphanize любой внеклеточный протеин интереса.
Protocol
Representative Results
Discussion
Значительное число сирот рецепторов остается в геноме человека, и Роман взаимодействующих партнеры продолжают появляться внеклеточных белков с ранее характеризуется лигандами. Определение рецептор лиганд взаимодействия человека и модельных организмов необходимо понять механизмы, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Philamer Calses и Юн Кобе за критически читать рукопись. Мы благодарны Рэнди иен за отличные технические консультации.
Materials
| Ultra Pure MB Grade glycerol | USB Corporation | 56-81-5 | Protein storage |
| SeptoMark blocking buffer | Zeptosens | BB1, 90-40 | Blocking buffer microarray slides |
| Bovine serum albumin | Roche | 03-117-957-001 | Slide control for mask fitting (optional) |
| Polypropylene multiwell plates | Greiner Bio One | 82050-678 | Protein storage |
| Polypropylene multiwell plates | Arrayit | MMP384 | Slide printing |
| NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Arrayit | NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Slide printing |
| Micro spotting pins | Arrayit | Micro spotting pins | Slide printing |
| ZeptoFOG blocking station | Zeptosens | ZeptoFOG blocking station, 1210 | Block slides after printing |
| Skim milk powder | Thermo Fisher | LP0031 | Blocking solution |
| Epoxysilane-coated glass slide | Nextrion Slide E | 1064016 | Microarray slides |
| Glass holder and slide rack set | Wheaton | 900303 | Slide storage |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA23031 | Albumin labeling |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | Human IgG labeling |
| Pro-spin desalting column | Princeton Separations | CS-800 | Remove free dye |
| Adhesive aluminum foil seal | AlumaSeal | F-384-100 | Seal stock plates |
| Polypropylene cryogenic vials | Corning | 430658 | Master vials for protein library storage |
| Protein A microbeads | Miltenyi | 120-000-396 | Query protein multimerization |
| Human IgG | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Irrelevant IgG for labeling |
| Protein A | Sigma | P7837 | Microarray slide blocking |
| Hybridization station, a-Hyb or similar | Miltenyi | Hybridization station, a-Hyb or similar | Automated microarray processing (optional) |
| GenePix 4000B scanner or similar | Molecular Devices | GenePix 4000B scanner or similar | Slide scanning |
| GenePix Pro or equivalent data extraction software | Molecular Devices | GenePix Pro or equivalent data extraction software | Data processing |
| Signal P4.1 | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites |
| TMHMM 2.0 server | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction of transmembrane helices in proteins |
| Phobius | Stockholm Bioinformatics Center | online software | A combined transmembrane topology and signal peptide predictor |
| TOPCONS | Stockholm University | online software | Prediction of membrane topology and signal peptides |
References
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there?. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
- Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. High-throughput identification of transient extracellular protein interactions. Biochemical Society Transactions. 38 (4), 919-922 (2010).
- Wright, G. J. Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions. Molecular BioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).
- Ramani, S. R., et al. A secreted protein microarray platform for extracellular protein interaction discovery. Analytical Biochemistry. 420 (2), 127-138 (2012).
- Tom, I., Lewin-Koh, N., Ramani, S. R., Gonzalez, L. C. Protein microarrays for identification of novel extracellular protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 27, 1-27 (2013).
- Kaushansky, A., et al. Quantifying protein-protein interactions in high throughput using protein domain microarrays. Nature Protocols. 5 (4), 773-790 (2010).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4730-4735 (2007).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
- Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions. Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).
- Voulgaraki, D., et al. Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor. Immunology. 115 (3), 337-346 (2005).
- Jiang, L., Barclay, A. N. Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents. Immunology. 129 (1), 55-61 (2010).
- Yeh, F. L., Wang, Y., Tom, I., Gonzalez, L. C., Sheng, M. TREM2 Binds to Apolipoproteins, Including APOE and CLU/APOJ, and Thereby Facilitates Uptake of Amyloid-Beta by Microglia. Neuron. 91 (2), 328-340 (2016).
- Jaworski, A., et al. Operational redundancy in axon guidance through the multifunctional receptor Robo3 and its ligand NELL2. Science. 350 (6263), 961-965 (2015).
- Martinez-Martin, N., et al. The extracellular interactome of the human adenovirus family reveals diverse strategies for immunomodulation. Nature Communications. 7, 11473 (2016).
- Nielsen, H. Predicting Secretory Proteins with SignalP. Methods in Molecular Biology. 1611, 59-73 (2017).
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes. Journal of Molecular Biology. 305 (3), 567-580 (2001).
- Kall, L., Krogh, A., Sonnhammer, E. L. Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction–the Phobius web server. Nucleic Acids Research. 35 (Web Server issue), W429-W432 (2007).
- Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A., Elofsson, A. TOPCONS: consensus prediction of membrane protein topology. Nucleic Acids Research. 27 (Web Server issue), W465-W468 (2009).
- Gonzalez, R., et al. Screening the mammalian extracellular proteome for regulators of embryonic human stem cell pluripotency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3552-3557 (2010).
- Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic Acids Research. 30 (2), E9 (2002).
- Battle, T., Antonsson, B., Feger, G., Besson, D. A high-throughput mammalian protein expression, purification, aliquoting and storage pipeline to assemble a library of the human secretome. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 9 (9), 639-649 (2006).
- Clark, H. F., et al. The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment. Genome Research. 13 (10), 2265-2270 (2003).
