Tecnología de microarrays de proteínas extracelulares para detección de alto rendimiento de las interacciones ligando-Receptor de baja afinidad
Summary
Aquí, presentamos un protocolo de pantalla proteína extracelular microarrays para la identificación de las interacciones receptor-ligando novela en alto rendimiento. También se describe un método para mejorar la detección de interacciones proteína-proteína transitorias mediante el uso de complejos de proteína-microbead.
Abstract
Factores secretados, receptores de membrana atada y sus socios interactúan son los reguladores principales de la comunicación celular y la iniciación de cascadas de señalización durante la homeostasis y la enfermedad y como tal representan dianas terapéuticas principales. A pesar de su importancia, estas redes de interacción quedan significativamente subrepresentadas en las bases de datos actuales; por lo tanto, más proteínas extracelulares no tienen ningún socio obligatorio documentado. Esta discrepancia es sobre todo debido a los problemas relacionados con el estudio de las proteínas extracelulares, incluyendo la expresión de proteínas funcionales y la débil, baja afinidad, las interacciones de la proteína a menudo se establece entre receptores de superficie celular. El propósito de este método es describir la impresión de una librería de proteínas extracelulares en un formato de microarray para la detección de interacciones proteína-proteína. Para habilitar la detección de interacciones débiles, se describe un método basado en multimerization de la proteína de consulta bajo estudio. Junto a esta base del microbead multimerization para mayor multivalency, el microarray de proteínas permite la detección robusta de interacciones proteína-proteína transitorias en alto rendimiento. Este método ofrece un muestra rápida y de bajo consumo de enfoque para la identificación de nuevas interacciones aplicables a cualquier proteína extracelular. Impresión de microarrays de la proteína y el protocolo de detección se describen. Esta tecnología será útil para los investigadores que buscan un método robusto para el descubrimiento de las interacciones de la proteína en el espacio extracelular.
Introduction
El método revisado aquí describe la impresión de una colección de proteínas extracelulares en un formato de microarrays, seguido de un método para la detección de un objetivo de interés contra esta biblioteca. Hemos identificado proteínas multimerization como un paso crucial para la detección de interacciones caracterizados por afinidades de unión baja. Para mejorar la detección de estas interacciones, se describe un protocolo basado en multimerization de la proteína de consulta de interés utilizando microesferas.
Segregada y superficie expresan proteínas de la célula (colectivamente llamadas proteínas extracelulares) junto con sus socios de la interacción son reguladores claves de la comunicación celular, la señalización y la interacción con el microambiente. Por lo tanto, son esenciales en la regulación de muchos procesos fisiológicos y patológicos. Aproximadamente un cuarto del genoma humano (≈5, 000 proteínas) codifica para las proteínas extracelulares, que, dada su relevancia y accesibilidad a medicamentos sistemáticamente entregados, representan objetivos claves para el desarrollo de drogas1. Por lo tanto, proteínas extracelulares representan más del 70% de los objetivos de la proteína con acción farmacológica conocida de medicamentos aprobados en el mercado, conocido como el “proteoma druggable”. A pesar de su importancia y abundancia, las redes de interacción (ePPI) proteína extracelular siendo muy subrepresentadas en las bases de datos disponibles. Esto es fundamentalmente debido a la complejidad bioquímica de las proteínas extracelulares, que impide su caracterización utilizando tecnologías más disponibles2. En primer lugar, las proteínas de membrana son difíciles de solubilizar, un proceso que implica a menudo las condiciones de lavado áspero y detergentes; en segundo lugar, proteínas extracelulares a menudo carecen de relevantes modificaciones post-traduccionales como glicosilación que están ausentes cuando estas proteínas se expresan en comúnmente utilizados sistemas heterólogos. Finalmente, las interacciones entre los receptores, tales como co receptores expresados en las células inmunes, suelen ser transitorios y caracterizado por afinidades muy bajo (KD en el ~ 1 μM a > rango μM 100). En conjunto, la naturaleza de estas proteínas y su enlace de socios hacen más ampliamente utilizado tecnologías como afinidad purificación/espectrometría de masas (AP/MS) o levadura-dos-híbrido, inadecuado para la detección de interacciones en el espacio extracelular 2 , 3.
En un esfuerzo por superar estos desafíos técnicos y acelerar el descubrimiento de nuevas interacciones de proteínas extracelulares, hemos desarrollado una cobertura alta proteína extracelular microarray4,5. Microarrays ofrecen la ventaja de generar superficies de alta densidad con pequeñas cantidades de muestra y son generalmente susceptibles a estudios de alto rendimiento. Estudios basados en microarrays de la proteína anteriormente han proporcionado penetraciones relevantes en las interacciones de la proteína para varios organismos modelo, aunque centrándose principalmente en interacciones citosólicas o proteína específica familias6,7, 8. Por el contrario, trabajo limitado se ha hecho para investigar las interacciones de la proteína extracelular utilizando esta tecnología. Hemos desarrollado un método de microarrays de proteínas para permitir estudios de ePPIs mediante la construcción de una biblioteca amplia y muy diversa de purificado proteínas secretadas y solo receptores transmembranales de (STM) expresan como recombinantes dominios extracelulares (ECD) fusionados a tags comunes para afinidad purificación4. El éxito de las pantallas de microarrays de la proteína depende en gran medida la creación de una biblioteca de proteína de alta calidad. Para la expresión de la proteína de la biblioteca y la consulta, células mamíferas o insectos fueron elegidos preferentemente como sistemas de expresión heteróloga, para asegurar la adecuada incorporación de modificaciones post-traduccionales como la glicosilación o disulfuro de bonos. SDS-PAGE, cromatografía por exclusión de tamaño y luz laser multi-angulo de dispersión son técnicas comúnmente utilizadas para evaluar la calidad de la proteína recombinante. La biblioteca de la proteína entonces es vista en diapositivas epoxysilane y almacenada a-20 ° C para uso a largo plazo. Concentraciones de proteína por encima de 0,4 mg/mL se recomiendan para el protocolo que se describe a continuación. Por lo tanto, baja expresando proteínas pueden requerir un paso de concentración antes de la impresión de la muestra y almacenamiento. Sin embargo, la principal ventaja de esta técnica es la escasa cantidad de proteína necesaria (50 μg de proteína es suficiente para llevar a cabo > 2.000 pantallas), junto con el consumo de proteínas de consulta mínima (20-25 μg por pantalla de duplicados). Utilizando el protocolo y el equipo descrito aquí, y siempre que las bibliotecas están disponibles, se pueden generar resultados para proteínas individuales de la consulta dentro de un día de trabajo.
Un desafío importante en la detección de interacciones de proteínas en el ambiente extracelular surge de su naturaleza característico débil o transitoria, que impide la identificación de metodologías más utilizadas. Aumentar la avidez de Unión grandemente mejora la sensibilidad para la detección de proteína débiles interacciones9,10,11. Basado en este principio se desarrolló un método para multimerize las proteínas de la consulta (expresadas como Fc fusión) usando proteína de granos recubiertos A4,5. Para evitar cualquier potencial inactivación de la proteína de la consulta por etiquetas al azar, en cambio etiqueta una irrelevante inmunoglobulina humana G con Cy5 y añadirlo junto con la proteína de la consulta a las perlas de proteína A, eliminando así cualquier artefactos debido a la conjugación directa de un colorante a la proteína de interés. Teniendo en cuenta las afinidades micromolar de varios pares de co-receptor, los complejos multivalentes mejoran relación señal a ruido, comparado con las proteínas de consulta de fusión Fc proyectadas como proteínas solubles4.
En Resumen, el objetivo de este protocolo es describir la preparación de microarray diapositivas que contiene una biblioteca de proteína extracelular preexistente para la identificación de las interacciones receptor-ligando. Repasamos los pasos para la diapositiva de la impresión, seguido de un protocolo para la detección de una proteína de interés contra la biblioteca de proteína extracelular. Por otra parte, se describe un método para la detección mejorada de ePPIs basados en microesferas para lograr mayor avidez de la proteína bajo estudio. La tecnología de microarrays de la proteína extracelular descrita aquí representa un enfoque rápido, robusto y eficaz para la investigación y detección de ePPI novela con baja proporción de falsos positivos y utilizando solamente cantidades de microgramos de la proteína de consulta bajo investigación. Esta tecnología ha impulsado varios estudios que han proporcionado penetraciones relevantes en funciones celulares desconocidas y vías de señalización para una variedad de receptores12,13, incluyendo virales immunoregulators14, y pueden ser utilizados para la orphanize cualquier proteína extracelular de interés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un número significativo de receptores huérfanos permanece en el genoma humano, y nuevos socios interactúan siguen apareciendo para proteínas extracelulares con ligandos previamente caracterizados. Definición de las interacciones ligando-receptor en humanos y organismos modelo es esencial para comprender los mecanismos que determinan la comunicación celular durante la homeostasis, así como desregulación conduce a la enfermedad y por lo tanto informar de nuevos o mejorados opciones terapéuticas. Sin embargo, la de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Philamer Calses y Kobe Yuen para leer críticamente el manuscrito. Estamos agradecidos a Randy yenes para asesoramiento técnico excelente.
Materials
| Ultra Pure MB Grade glycerol | USB Corporation | 56-81-5 | Protein storage |
| SeptoMark blocking buffer | Zeptosens | BB1, 90-40 | Blocking buffer microarray slides |
| Bovine serum albumin | Roche | 03-117-957-001 | Slide control for mask fitting (optional) |
| Polypropylene multiwell plates | Greiner Bio One | 82050-678 | Protein storage |
| Polypropylene multiwell plates | Arrayit | MMP384 | Slide printing |
| NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Arrayit | NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Slide printing |
| Micro spotting pins | Arrayit | Micro spotting pins | Slide printing |
| ZeptoFOG blocking station | Zeptosens | ZeptoFOG blocking station, 1210 | Block slides after printing |
| Skim milk powder | Thermo Fisher | LP0031 | Blocking solution |
| Epoxysilane-coated glass slide | Nextrion Slide E | 1064016 | Microarray slides |
| Glass holder and slide rack set | Wheaton | 900303 | Slide storage |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA23031 | Albumin labeling |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | Human IgG labeling |
| Pro-spin desalting column | Princeton Separations | CS-800 | Remove free dye |
| Adhesive aluminum foil seal | AlumaSeal | F-384-100 | Seal stock plates |
| Polypropylene cryogenic vials | Corning | 430658 | Master vials for protein library storage |
| Protein A microbeads | Miltenyi | 120-000-396 | Query protein multimerization |
| Human IgG | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Irrelevant IgG for labeling |
| Protein A | Sigma | P7837 | Microarray slide blocking |
| Hybridization station, a-Hyb or similar | Miltenyi | Hybridization station, a-Hyb or similar | Automated microarray processing (optional) |
| GenePix 4000B scanner or similar | Molecular Devices | GenePix 4000B scanner or similar | Slide scanning |
| GenePix Pro or equivalent data extraction software | Molecular Devices | GenePix Pro or equivalent data extraction software | Data processing |
| Signal P4.1 | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites |
| TMHMM 2.0 server | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction of transmembrane helices in proteins |
| Phobius | Stockholm Bioinformatics Center | online software | A combined transmembrane topology and signal peptide predictor |
| TOPCONS | Stockholm University | online software | Prediction of membrane topology and signal peptides |
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