Summary
כאן נתאר החיסונים של הבוגרים דג זברה (רזבורה rerio) עם חיסון מבוסס DNA עבור פרוטוקול להדגים את האימות של אירוע מוצלח חיסון. שיטה זו מתאימה להקרנה פרה של החיסון מועמדים במודלים שונים של זיהום.
Abstract
עניין החיסונים מבוסס DNA גדל במהלך שני העשורים האחרונים. חיסון DNA מבוסס על השיבוט רצף של אנטיגן שנבחר או שילוב של אנטיגנים לתוך פלסמיד, המאפשרת עיצוב בהתאמה אישית ובטוחה. מתן של חיסונים DNA לתוך התאים המארחים מוביל הביטוי של אנטיגנים המעוררים תגובות חיסוניות ההורמונאלית והן תאית. הדו ח מתאר פרוטוקול עבור השיבוט של אנטיגן רצפי לתוך פלסמיד pCMV-EGFP, החיסונים של דג זברה למבוגרים עם המועמדים חיסון על ידי microinjection תוך שרירית, את אלקטרופורציה עוקבות לשפר צריכת. חיסון נגד אנטיגנים מבוטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)-פיוז'ן חלבונים, אשר מאפשר את האישור של הביטוי אנטיגן תחת אולטרא סגול חי דג, כימות של רמות הביטוי של החלבון פיוז'ן עם אליסה, כמו גם בתור הזיהוי שלהם עם ניתוח תספיג חלבון. ההשפעה המגנה של המועמדים חיסון נבדק ע י הדבקה הדג עם התחממות עולמית חמישה שבועות postvaccination, ואחריו כימות של החיידק עם qPCR אחרי 4 שבועות. לעומת מודלים בתרבית של ההקרנה פרה, שיטה זו מספקת שיטה חסכונית להקרנה ראשוני של מועמדים חדשניים מבוססי DNA חיסון נגד דלקת mycobacterial. השיטה ניתן להחיל עוד יותר כדי הקרנת מבוסס DNA חיסונים נגד מחלות שונות בקטריאליים וויראליים.
Introduction
המחקרים חיסון DNA הראשונה בוצעו ב שנות ה-901, מאז, חיסונים DNA נבדקו נגד מחלות זיהומיות, סרטן, מחלת חיסון עצמי, וקשורות אלרגיה2. ביונקים, חיסון DNA נגד וירוס הנילוס המערבי אצל סוסים וחיסון טיפולי סרטן מלנומה הפה הכלבי חייב ברשיון, אך אלה לא כיום שימוש קליני2. בנוסף ריבית עורר על ידי מחקרים יונקים, חיסון DNA הפכה להיות דרך נוחה כדי לחסן את הדגים מעובדים נגד מחלות ויראליות. חיסון נגד וירוס מדבק נמק hematopoietic דגים (IHNV) כבר בשימוש מסחרי מאז 2005, חיסון נגד וירוס נמק הלבלב זיהומיות (IPNV) היה לאחרונה מורשה3. בנוסף, מספר חיסונים DNA נגד פתוגנים דגים מפותחים.
כמו חיסונים מסורתי מכילות לעתים קרובות פתוגנים הקלוש מוחלש או בשידור חי, הם מהווים סיכון פוטנציאלי של העברת המחלה2. חיסונים DNA, בתורו, למנוע סיכון זה, כפי שהם מבוססים על הממשל של פלסמיד קידוד אנטיגנים חיידקי או ויראלי, יותר מאשר המחלה כל עצמו2,4. חיסונים DNA מיוצרים בטכניקות רקומבינציה הדנ א, אשר מאפשר עיצוב מדויק של חיסון נגד אנטיגנים, ניסוח גמיש של אנטיגן שילובים וחיסונים adjuvants לבנות5חיסון יחיד. יתר על כן, בייצור חיסונים DNA הוא מהיר יותר, קל יותר, יעיל יותר מזה של חלבון מבוססת חיסונים רקומביננטי, וזה יתרון גדול עבור המועמד חיסון הקרנת למטרות, אלא גם, למשל, במקרה של התפרצות מגיפה 2.
בדגים, המסלולים המינהל הנפוץ ביותר עבור חיסונים DNA בקרום הבטן, תוך שרירית, אוראלי3,6,7, ואילו אצל יונקים, תת עורית, אפשרויות נוספות2מסלולי intradermal. לאחר זריקה תוך שרירית, פלסמידים דנ א administrated הזן את התאים באתר המינהל (למשל., בעיקר של תאי שריר, אבל גם תאים אנטיגן תושב [נגמ שים]). היחס של תאים transfected ניתן להגדיל באופן משמעותי על ידי אלקטרופורציה2,8. לאחר הזנת התא, כמה פלסמיד DNA נכנס לגרעין, איפה הגנים המקודדים על ידי פלסמיד משועתקים2. ב פרוטוקול זה, אנו מנצלים את פלסמיד pCMV-EGFP בעל מקדם בכל מקום חזק אופטימיזציה עבור הביטוי האיקריוטים9. בתוך המבנה הזה, האנטיגנים מתורגמים כמו חלבון פיוז'ן עם ה-GFP. ה-GFP מפעילה האישור של חיסון מוצלחת ואת המוצר הנכון אנטיגן החזיית אנטיגן ביטוי פשוט עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות בדגים חיים.
ביונקים, חיסונים DNA הוכחו לעורר סוגים שונים של תגובות חיסוניות בהתאם תא transfected סוגי2,5. נייטרלים transfected להפריש אנטיגנים לחלל חוץ-תאית או לשחרר אותם על מוות של תאים, אנטיגנים נבלע על ידי נגמ שים, לאחר מכן, מוצגים histocompatibility הגדולות מורכבות II מולקולות2. זה מעורר תגובות תאי CD4 ו- CD8 T, במיוחד, בנוסף תא B תגובות2,5,10. בדגים, לימפוציטים T ו- B, כמו גם תאים דנדריטים (Dc), זוהו, אך את חלוקת העבודה במצגת אנטיגן הוא פחות מובן היטב11. דג זברה DCs, עם זאת, הוכחו חולקות מאפיינים שנשמרת פנוטיפי ופונקציונליים עם שלהם בתרבית של עמיתיהם12. יתר על כן, חיסון DNA הוכח לעורר תגובות חיסוניות דומה דגים, יונקים, כולל T ו- B cell תגובות6,13,14,15,16 .
הזחלים וגם דג זברה למבוגרים נמצאים בשימוש נרחב כדי מחלות זיהומיות שונות של מודל, כגון דגים התחממות עולמית מ מודל זיהום שחפת בשימוש זה פרוטוקול17,18,19,20 21, ,22. בהשוואה אורגניזמים יונקים מודל, היתרונות של דג זברה כוללות גודל קטן, מהיר הפארמצבטית, נמוך דיור הוצאות23. היבטים אלה הופכים דג זברה במודל חיה אידיאלי ללימודי ההקרנה פרה בקנה מידה גדול עבור חיסונים הרומן ותרכובות פרמצבטיות23,24,25.
ב פרוטוקול זה, אנו מתארים איך הרומן אנטיגן חיסון מועמדים נגד mycobacteriosis יכול להיות מוערך על ידי החיסון מבוסס DNA של דג זברה למבוגרים. ראשית, אנו מתארים איך אנטיגנים הם משובטים לתוך פלסמיד הביטוי pCMV-EGFP, ואחריו עבור הזרקה תוך שרירית של החיסון פלסמידים ואלקטרופורציה עוקבות של פרוטוקול מפורט לתוך השריר. הביטוי של כל אנטיגן אושר על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ שבוע postimmunization. היעילות של המועמדים אנטיגן מכן נבדק על ידי השפעול מדביק שחוסנו דג עם התחממות עולמית מ'.
Protocol
ניסויים כולל דג זברה בוגרת דורשים הרשאה עבור ניסויים בבעלי חיים החיסון וגם המחקרים הבאים עם המודל זיהום. כל שיטות וניסויים המתוארים כאן המאושרים על-ידי חיות ניסוי לוח של פינלנד (ESAVI), הלימודים מתבצעים תחת האיחוד האירופי הוראת 2010/63/האיחוד האירופי.
1. שכפול של אנטיגנים חיסון DNA
- בחר על פלסמיד ביטוי ממוטב עבור הביטוי האיקריוטים של antigen(s) עניין תחת חזקים, מכוננת מקדם מכירות, כגון האמרגן מוקדם מיידי cytomegalovirus (CMV). כדי לאפשר אימות ויוו של הביטוי אנטיגן, בחר פלסמיד חיסון מקודד תגית פלורסנט, כגון פלסמיד pCMV-EGFP9 שימוש בפרוטוקול זה.
- השתמש כלי מבוסס-אינטרנט, bioinformatic המתאים כדי לבחור רצף אנטיגן פוטנציאל החיסון-מגן (או מספר רצפים) של 90 – 600 nt (30-200 aa)26 מתוך gene (s)-של-עניין לנגיף זה ישמש מודל זיהום לאחר מכן.
- להשתמש בתוכנה זמינים, או באופן ידני עיצוב תחל כדי להגביר את הגנים אנטיגן מן הגנום הפתוגן וכדי לשכפל את sequence(s) אנטיגן לתוך האתר מרובות כשכפול של פלסמיד הביטוי. הקפד לשמור על המסגרת קריאה נכונה בעת בחירת אנטיגן.
- כלול פריימר 5' של רצף (CCACC) קוזאק27 והן של codon התחלה (ATG). כדי לשמר את התג EGFP C-מסוף, להימנע להתערב עצירה codons (תג, TAA, TGA) את רצף אנטיגן, ומהצמיגים 3'. בנוסף, עליך לוודא כי תג ה-GFP נשאר באותה מסגרת הקריאה עם אנטיגן של עניין.
- השתמש RNA או DNA שחולצו מן המחלה כתבנית כדי להפיק כמות מספקת של מוצר ה-PCR עם תחל השיבוט. רצוי, השתמש של פולימראז DNA ההגהה כדי לשמר את הרצף הנכון אנטיגן.
- לטהר את המוצר PCR וסמנו בגודל הנכון של המוצר על ידי אלקטרופורזה בג'ל. לעכל, מאתרים ומפסיקים את המוצר PCR עם פלסמיד החיסון מעוכל.
- להפוך את התמהיל מצדו תאים חיידקיים המוסמכת על-פי פרוטוקול מתאים. מבחר אנטיביוטי המתאים לשימוש מושבות חיובי וייצור פלסמיד ב e. coli; פלסמיד pCMV-EGFP, לדוגמה, מכיל גנים עמידות של אמפיצילין בשביל זה.
- השתמש סנגר רצף כדי לאשר את ההוספה של הרצף הנכון אנטיגן. תחל הבאים יכול לשמש עבור רצף אנטיגנים בתוך פלסמיד pCMV-EGFP: CMV להעביר 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3 'ו 5' CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3 EGFP-N הפוך'.
- לייצר ולטהר כמות מספקת של הבונה חיסון. להמיס או elute את פלסמיד במים סטריליים. ודא כי ה-DNA פלסמיד המיוצרים באיכות גבוהה והוא הריכוז מיקרומטר לפחות 0.72 או 2,000 ng/µL.
2. מושך את המחטים Microinjection
- להכין מראש microinjection מחטים. השתמש נימים זכוכית aluminosilicate ס מ-10. שים לב נימים זכוכית בורוסיליקט שביר מדי עבור הזרקת דגים למבוגרים.
- משוך את המחטים עם מכשיר micropipette-מחט-בדיית '.
הערה: המחטים צריך להיראות דומה לזה המוצג באיור1. עם המכשיר בשימוש פרוטוקול זה (טבלה של חומרים), ההגדרות הבאות להוספת הסוג הרצוי של מחטים:- להגדיר את הזכוכית נימי ב- V-groove בבר פולר, והדק את כפתור clamping בקלילות.
- העבר המחזיק ליד חוט הלהט, דחף בעדינות את נימי דרך חוט הלהט לתוך שורת פולר בצד השני של חוט הלהט. להימנע מלגעת הלהט עם נימי.
- להדק את ידיות clamping, תניח את זכוכית בטיחות, ולחץ על לחצן משיכה.
התראה: הסיב הוא חם.
- מקם את המחטים על חתיכה של דבק לשימוש חוזר בתוך צלחת פטרי 15 ס מ כדי להגן על העצות המחט. שמור את צלחת מכוסה כדי לשמור את המחטים נקי.
3. מילוי את המחטים Micropipette
- מכינים את תערובת חיסון. השתמש µg 0.5 – 12 של פלסמיד למנה. אם שילוב מספר פלסמידים שונים בתמהיל חיסון אחד, השתמש ריכוז ה-DNA הכולל המרבי של µg 12 לכל דג.
- חישוב הנפח של החיסון "מאסטר מיקס" על פי מספר דגים בכל קבוצה (ראה להלן). להוסיף 1 µl של סטרילי-מסוננים פנול אדום כל מנה הזרקת להקל גם מילוי קפילרי המחטים וגם התצפית של הזריקה. להוסיף 1 סטרילי x PBS עד הנפח הכולל המרבי של 5-7 µl זריקה אחת מנה8.
הערה: הזרקת אמצעי אחסון גבוה יותר 7 µL עלולה לגרום לדליפת ומדי פעם הפתרון הזרקת ולא, לכן, יש להימנע. - מניחים נייר-דבק, דבק בצד, מחזיק המתאים, לדוגמה, את הצד של קופסת עצה ריק. בעדינות לצרף את המחטים נימי בקלטת.
- Pipet היותר 7 µL של המיקס החיסון על חתיכת סרט מעבדה. באמצעות טיפ הטעינה, להעביר את החיסון מהסרט לתוך המחט. Pipet לאט ובזהירות, להימנע pipetting בועות אוויר לתוך המחט.
- תן את המחטים להתפשר על 15-30 דקות להסיר אפשרי בועות אוויר קטנות הנותרים.
4. הגדרת את Microinjector ואת Electroporator עבור חיסונים
- הגדר את micromanipulator ואת מקור אור למיקום הנכון. לעבור את הברז לחץ האוויר למצב פתוח.
- כוונן את הפרמטרים עבור פנאומטיים משאבה כדלקמן (ראה גם איור 2).
- להגדיר את כפתור פתח יציאה הוצאה להחזיק למנוע למלא את משבצות של פיפטה על ידי נימיות. הגדר את צינורות מן הנמל הוצא micropipette. אל תשתמש יציאת ואקום של פרוטוקול זה.
- להתאים את הדופק אורך: להשתמש את מתוזמן מצב, בו שעון העצר של אלקטרונית שולט משך הזמן ברז חשמלי הלחץ נשאר פתוח. בדוק המנורה הירוקה ליד מד הלחץ ההוצאה המאיר כאשר סולנואיד לחץ לפתיחה (אנרגיה).
- להגדיר את הדופק טווח עד 10 s; עם הגדרה זו, הפולסים ניתן עוד יותר להגדיר מ-100 מילישניות לשימוש ס' 10.1 את פרק 10-תור חייג להתאמות האורך הדופק – כל צעד ושעל של החיוג הוא 1.0 s. אם יש צורך, זה יכול גם להיות מותאם במהלך זריקה.
- השתמש היוזם הדופק ("התחל לחצן") בלוח הקדמי של המשאבה פנאומטיים, או של מרחוק רגל מתג (מומלץ). זה קשור הפאנל הקדמי של המשאבה פנאומטיים.
- הגדר את המחט אל micropipette האוחז micromanipulator. חותכים את קצה המחט עם פינצטה כך נוזל יכול להידחף, והוא השתמש במיקרוסקופ כדי להציג את המיקום הנכון. הקש את מפסק רגל פעם לראות דופק 1-s דוחף droplet קטן מחוץ המחט.
- השתמש בהגדרות הבאות electroporator: מתח = 40 וולט; דופק אורך = 50 מילישניות, מספר פולסים = 6. לחבר את הפינצטה electroporator. ראה כי בפועל מתח ואורך הדופק שמוצג על המסך לא נבדלים באופן משמעותי ההגדרות.
5. הזרקה של חיסון DNA ואלקטרופורציה
- החיסונים לפי פרוטוקול זה, שימוש בריא, 6 עד 12 בן חודש למבוגרים דג זברה. לשמור את הדגים בתוך מערכת זרימה דרך עם מחזור/כהה 14/10 h, עם מספר מרבי של דגים שבעה לכל 1 ליטר של מים.
- היכונו מאלחש של דגים280.02% 3-aminobenzoic חומצה אתיל אסתר (tricaine) פתרון (pH 7) בהמים במיכל. השתמש צלחת פטרי 10 ס מ או משהו דומה.
- הכינו טנק השחזור על-ידי ממלא גביע 5 L L 3 ב'נקה מערכת מים.
- להכין חיסון לתוכנו כדי לשמור על הדגים בעמדה קבועה במהלך החיסון. לקחת חלק2 5 x 7 ס מ 2 ספוג בעובי ס מ 3. חותכים חריץ בספוג עם להב סכין או מספריים.
הערה: ניתן להשתמש הריפוד חיסון זהה בניסויים מרובים. לחטא את הספוג בין הניסויים בהשריה 70% אתיל אלכוהול, אפשר להתייבש. - ביסודיות מספיג את הספוג במים המערכת והגדר את הספוג על צלחת פטרי.
- מהר הדג 24 שעות לפני החיסונים.
- עזים ומתנגד אחד דג זברה על-ידי הצבתו על צלחת פטרי המכילות tricaine 0.02%. המתן עד הדג אינו מגיב למגע גירוי, עד שלא יהיה שום תנועת הזימים. עזים ומתנגד דג בודד בכל פעם.
- באמצעות כף פלסטיק, להעביר את דג זברה anesthetized על גבי הספוג הרטוב, תניח בצד הגחוני של הדג לתוך החריץ. בתנוחה הנכונה, לוודא את הראש ואת רוב הגוף של הדגים נמצאים בתוך החריץ וסנפיר הגב והזנב הן בולטות החוצה מ- groove.
- תחת המיקרוסקופ, בזהירות המקום את המחט כ 45° זווית קרוב שריר הגבי של דג זברה, באמצעות את ציר x ו- y כוונון גלגלי, micromanipulator.
- למצוא את המקום קטן ללא קשקשים מול וסנפיר הגב, איפה לדחוף את המחט אינה דורשת כוח. אם התנגדות מורגשת, נסה מקום סמוכים. הימנע ופצעו את עמוד השדרה, את וסנפיר הגב או את המאזניים.
הערה: אם המחט מתכופף תוך דחיפת, לקצר את המחט מעט על ידי חיתוך זה. - השתמש בבורר הרגל בהדרגה להחדיר את הפתרון חיסון לתוך השריר. לצפות את הזריקה מבעד למיקרוסקופ: פנול אדום הוא גלוי המתאוששת לרקמת שריר. התאם את משך הזמן של הדופק במידת הצורך.
הערה: לחלופין, השתמש בלחצן יוזם הדופק בלוח הקדמי של המשאבה פנאומטיים על הזריקה. עם זאת, השימוש בבורר רגל מרחוק מאפשרת באמצעות היד השנייה על התאמת אורך הדופק ליד הגלגל 10-להפוך חיוג. הימנע הזרקת הפתרון מהר מדי, שכן הדבר עלול לגרום נזק לרקמות מוגזמת. הקפד לא להזריק כל האוויר. - Electroporate הדג מיד לאחר ההזרקה. ודא כי הדג הוא עדיין תחת הרדמה. לשמור את הדגים על הספוג ולהגדיר את הדג בין פינצטה-סוג אלקטרודות, כך האלקטרודות ממוקמות בכל צד של ההזרקה. אין להקיש את הפינצטה אלקטרודה חזק מדי אבל שתי אלקטרודות בקשר עם הדג.
- ליחצו על כפתור התחל electroporator לתת 40 שש V, פולסים 50 מילישניות.
- בעדינות להעביר את הדגים למיכל השחזור.
- לנקות את האלקטרודות אלקטרופורציה כל על-ידי העברת אותם עם 70% אתנול.
הערה: לנטר בקפידה לרווחתם של הדג אחרי החיסון. המתת חסד דגים מראה סימנים של אי נוחות (החלמה איטית מן ההרדמה, סוטה שחיה, מתנשף) ב- 0.04% tricaine. לאחר התאוששות, להעביר את הדגים יחידת זרימה דרך ואאכיל אותו בדרך כלל.
6. ויזואליזציה והדמיה של אנטיגן ביטוי
- עזים ומתנגד הדג ב- 0.02% tricaine 2-7 ימים לאחר חיסון, והשתמש אור UV לראות ביטוי EGFP ליד ההזרקה.
הערה: בדיקה ויזואלית תחת אור UV הוא ניתוח קל ולא פולשני מתאימה עבור אימות שגרתית של חיסונים מוצלח, גם בניסויים בקנה מידה גדול. אם אין תמונות של הדגים נדרשים, ניתן לבצע שלב זה גם במיכלים דג רגיל ללא צורך עזים ומתנגד או להזיז את הדג. - כדי ללכוד תמונות, להשתמש במיקרוסקופ פלורסצנטיות להמחיש ביטוי EGFP האתר של הזרקת8. השתמש בעדשה המטרה X 2 ובחר את המסנן הנכון כדי להמחיש זריחה או תצוגות אור לעין.
- לשמור את הדגים anesthetized עדיין על ידי לחיצה על הפרק הגחוני / בעדינות עם הפינצטה כלפי תחתון פטרי. קח תמונות אור-מיקרוסקופ והן זריחה באותו האזור.
- למזג את אור-מיקרוסקופ ותמונות פלורסצנטיות באמצעות תוכנה מתאימה29. להוסיף סרגל קנה מידה.
7. כימות רמת הביטוי והגודל של אנטיגנים
- המתת חסד של הדגים 0.04% tricaine. לנתח את החלק פלורסנט של שריר הגבי עם האזמל, פינצטה תחת אור UV. תמצית חלבונים מן הדגימות8.
- ודא בגודל הנכון של in vivo-מיוצר חלבונים עם ניתוח תספיג, שימוש של חזרת peroxidase (HRP)-נוגדן GFP מצומדת (או דומה)8. לכלול פקד שלילי (דגים unimmunized) כדי לא לכלול כל רקע אותות ואיגוד לא ספציפי, יחד עם פקד לבטא EGFP ללא אנטיגן מאוחה.
הערה: לניתוח תספיג, הגודל הצפוי (ב- kDa) של החלבונים אנטיגן-fusion ניתן לחשב, לדוגמה, על ידי המשוואה:
מולקולרית משקל (MW) של dsDNA = (מספר נוקלאוטידים x 607.4) + 157.9; או על ידי שימוש בכלים מבוססי-אינטרנט. - לכמת את הביטוי של כל אנטיגן באמצעות ה-GFP-אליסה8 (אופציונלי).
8. שילוב פרוטוקול חיסון עם מודל זיהום מ התחממות עולמית
- לקבוע את גודל הקבוצה הנדרש לקביעת אמין האפקטיביות של מועמד חיסון חדשניים המודל זיהום ואת וזמינותו בשימוש (ר', למשל, Myllymaki et al. 24 Charan, Kantharia30). לבצע את החישובים המתאימים כוח בעת תכנון הניסויים.
- כדי להעריך את היעילות של החיסון מועמדים, להדביק את postimmunization 5 שבועות של דגים. השתמש זיהום בקרום הבטן עם-30 המושבה יוצרי יחידות (cfu) של מסיה התחממות עולמית, כשבסופו דלקת סמויה ברוב דגים8,20,31.
הערה: בעת שימוש מ התחממות עולמית, בצע נוהל בטיחות BSL2. הכנת החיידק או הנגיף תלויה הפתוגן. - לכמת את מספר פתוגנים בתוך כל דג. המתת חסד postinfection 4 שבועות של דגים ולקבוע את הנטל חיידקי ב כל דג מן ה-DNA שחולץ עם qPCR באמצעות תחל ספציפי עבור התחממות עולמית מ20,24.
הערה: הקפד לכלול קבוצת הפקד המתאים ולהשתמש השיטות הסטטיסטיות הנכונה לניתוח התוצאות. באופן כללי, קבוצת דגים חיסון עם פלסמיד pCMV ריק-EGFP הוא פקד שלילי מתאים. - אשר תוצאות חיוביות עם אנטיגנים ללא תג ה-GFP. שיבוט האנטיגנים כפי שמתואר בשלב 1, חזור על הניסוי החיסון.
Representative Results
הצעדים הכרוכים פרוטוקול חיסון DNA של דג זברה בוגרת מומחשים באיור3. בהתחלה רצפי אנטיגן שנבחרו הם משובטים לתוך פלסמיד pCMV-EGFP, דנ א פלסמיד מופק וטיהרו24 (איור 3). חיסון מועמדים לאחר מכן מוזרקים intramuscularly עם microinjector והוא ההזרקה electroporated כדי לשפר את צריכת פלסמיד לתאים (איור 3). המינון חיסון רגיל היה אופטימיזציה על ידי הזרקת כמויות שונות של פלסמיד pCMV-EGFP ומדידת הביטוי GFP עם אליסה (Supplementary איור 1). 2 ל 7 ימים postvaccination, הביטוי של החלבון פיוז'ן זוהה תחת אור UV, דמיינו מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (איור 3 ו- 4 באיור). רמות הביטוי של אנטיגנים שונים עשוי להשתנות מאוד אינטנסיבית (אנטיגן 1) כדי ביטוי חלש (איור 4). בנוסף, ה-GFP הביטוי יכול להיות שנצפו על פני השריר הגבי (אנטיגן 1), או באזור מוגבל יותר (אנטיגן 2) (איור 4). עם זאת, אם לא זריחה מתגלה תוך 10 ימים, מומלץ לוודא כי ישנם טעויות בעיצוב להכפלה או פריימר אנטיגן. כדי לוודא חלבון כימרי ביטוי של הגודל הנכון, חלבונים יכול להיות מופק לרקמת שריר סביב ההזרקה, המשמש עבור ניתוח תספיג חלבון.
ההשפעה של המועמדים חיסון מוערך על-ידי מאתגר את הדג עם מינון נמוך של התחממות עולמית מ' על ידי זריקה בקרום הבטן (איור 5). Postinfection ארבעה עד חמישה שבועות, ספירת חיידקים נחושים עם qPCR, לעומת המון חיידקים בקבוצת הביקורת (איור 5). יתר על כן, ניתן לבדוק את האפקטיביות של המועמדים חיסון המבטיחים ביותר על-ידי ניטור ההישרדות לאחר מינון גבוה מ התחממות עולמית זיהום(איור 5). עם זאת, בנוסף נותן תוצאה כמותיים על ההתקדמות של הזיהום, במקום רק מצב של חיים או מתים, כימות cfu מבוססי qPCR דורש פחות זמן קטן קבוצת הגדלים ואת היא, לכן, גישה מוסרית יותר עבור תחום ראשי מסך. בסך הכל, פרוטוקול זה מקלה על היעילות של החיסון הרומן אנטיגנים הקרנת הסרט תוך 12 שבועות (איור 5).
איור 1: צילום מקרוב (12 X) של מחטים aluminosilicate המשמשים את הזריקות אינטרה שרירים דג זברה בוגרת. המידע שלהלן נחתך עם פינצטה והוא מוכן לשימוש עבור microinjections. איור זה כבר ממאמרו של Oksanen35. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: הגדרת וציוד Microinjection. הרכיבים העיקריים של כל הציוד הדרוש לעשות חיסון DNA של דג זברה בוגרת מסומנים באותיות מודגשות. ההתאמות קריטיים מסומנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: הכנת את פלסמידים חיסון DNA וההליך חיסון. (1) נבחר אנטיגנים משוכפלות סמוכים על תג ה-GFP ב פלסמיד pCMV-EGFP. (2) החיסון לבנות הפיק microbiologically, מרוכז, מטוהרים. (3) 12 µg של פלסמיד מוזרק לתוך השריר הגבי של דג זברה בוגרת anesthetized עם microinjector ולאחר ההזרקה הוא לאחר מכן electroporated עם שש 40-V, 50-ms פולסים. (4) 2-7 ימים postvaccination, הביטוי GFP של החלבון פיוז'ן אנטיגן-GFP הוא מדמיין עם מיקרוסקופ זריחה. (5) פלורסנט חלק השריר הגבי יכול להיות גזור ומשמשת להפקת חלבון. הגודל של החלבון היתוך הוא אישר עם ניתוח תספיג ואת רמת ביטוי עם GFP-אליסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: להמחיש את הביטוי של החלבון פיוז'ן אנטיגן-EGFP. מרדימים דג זברה למבוגרים הם שחוסנו µg 12 של חיסון ניסיוני אנטיגנים (אנטיגן 1 – 3), ההזרקה electroporated, לאחר מכן, עם שישה 40 V, פולסים 50 מילישניות. 2 ל 7 ימים postvaccination, ההזרקה הוא תמונה עם מיקרוסקופ. ראשית, הביטוי של GFP מזוהה תחת מיקרוסקופ זריחה. האזור נבדק באמצעות מטרה בסדר גודל X 2, עם תמונה, נשמר בצורה .tiff. תמונת מיקרוסקופ אור באותו האזור מתמזג עם התמונה פלורסצנטיות באמצעות התוכנה ImageJ. הכמות והמיקום של הביטוי אנטיגן עשויים להשתנות בין אנטיגנים דגים בודדים. לדוגמה, הביטוי של אנטיגן 1 נצפית על פני השריר הגבי, הביטוי של אנטיגן 2 נתפסת. נקודות קטנות, ואילו אנטיגן 3 מתבטא בחריפות אזור מוגבל יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: בדיקת האפקטיביות של מועמדים חיסון נגד דלקת mycobacterial. דג זברה (1) למבוגרים הם שחוסנו ניסיוני חיסונים DNA נגד mycobacteriosis. (2) postvaccination חמישה שבועות, הדגים נגועים עם מינון נמוך של התחממות עולמית (cfu ~ 30). (3) ארבעה שבועות מאוחר יותר, הפנימי איברים גזור, המשמש להפקת DNA. (4) הרוזן חיידקי כל דג לכמתו qPCR באמצעות התחממות עולמיתמתחל ספציפיים. חיסון עם אנטיגן 1 הובילה ירידה משמעותית ספירת חיידקים (p < 0.01, ANOVA דו-כיווני), בעוד אנטיגנים 2 ו- 3 לא היתה השפעה. (5) המגן ההשפעה של המועמד חיסון המבטיחים ביותר (אנטיגן 1) מחושבת נוסף בניסוי הישרדות, דגים נגועים עם מינון גבוה (~ 10,000 cfu) של חיידקים ואיפה ההישרדות שלהם להשגחה במשך 12 שבועות. מסתדר עם הירידה הנטל חיידקי שנצפתה לוח 4, חיסון עם אנטיגן 1 גם שיפור ההישרדות של הדג על זיהום מ התחממות עולמית (p < 0.01), רומז אנטיגן זו יכולה להיות התחלה מבטיחה. מועמד חיסון חדש נגד שחפת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלים איור 1: כמות פלסמיד DNA משפיע על פלסמיד, נגזר EGFP ביטוי דג זברה בוגרת. קבוצות של דגים (n = 5 בכל קבוצה) הוזרקו 0.5 – 20 μg של pCMV-EGFP, אלקטרופורציה (שישה פולסים של 50 V) נעשה שימוש כדי לשפר את תרביות תאים. שליטה דגים (CTRL) הוזרקו 2 μg של פלסמיד pCMV ריקה אשר אינו מכיל את הגן EGFP. GFP-אליסה הייתה בביצוע 3 ימים postinjection להגדיר את הביטוי EGFP היחסי דגים homogenates. P-ערכים: *p < 0.03, * *p < 0.004. קווי השגיאה מייצגים סטיות תקן. NS = לא משמעותי. איור זה כבר ממאמרו של Oksanen35. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
ההליך של immunizing דג זברה למבוגרים עם חיסונים מבוסס DNA מחייבת מומחיות טכנית כלשהי. אפילו בשביל חוקר מנוסה, חיסון דג בודד לוקח כ- 3 דקות, לא כולל ההכנות. לפיכך, לכל היותר בערך 100 דגים יכולים להתחסן תוך יום. אם יותר מ-100 דגים דרושים לניסוי, אפשר לחלק את החיסונים עד 3 ימים. בנוסף האיכות של הניסוי, הכשרה מספקת של researcher(s) עבור טיפול הדגים וביצוע חיסונים חיוני לרווחתם של הדג. הקפד לעקוב אחר הנחיות וכללים משפטיים ובעלי חיים הרווחה כשמדובר דיור הדג, תכנון הניסויים, את הכישורים הנדרשים עבור אנשי בביצוע הניסויים.
לסיכום, ישנם מספר שלבים קריטיים כדי להימנע מסיבוכים בפרוטוקול חיסונים. עבור חיסון מוצלחת, ודא כי 1) כדי להתחסן שהדגים מספקת ובריאה גיל וגודל (החיסונים של דגים ילדותי יותר תוכל לדרוש למטה-שינוי גודל האחסון החיסון ואת הגדרות אלקטרופורציה); 2) הדגים הם מרדימים כראוי ללא חזק יותר 0.02% 3-aminobenzoic חומצה אתיל אסתר, והם נשארים anesthetized לאורך כל ההליך כולו (הרדמה צריך להישמר קצר ככל האפשר להבטיח ההתאוששות של הדגים); 3) משטח ספוג ספוגה כראוי; 4) נוזלי מוזרק בדופק כל מהמשאבה פנאומטיים, ואם לא, האורך הדופק הוא שינוי (מושך את המחט מעט לאחור לאורך ציר ה-y יכול לעזור); 5) יש אין בועות אוויר עם הפתרון חיסון; 6) את הגדרות אלקטרופורציה ואת הדופק בפועל מתח אורך נכונים; 7) האלקטרודות אינם גורמים נזק לעור באתר אלקטרופורציה (במהלך אלקטרופורציה, שמור האלקטרודות בעדינות קשר עם הדג, ולשחרר את הדג מיד לתוך הטנק התאוששות לאחר אלקטרופורציה).
חשוב לנטר את הדג אחרי אלקטרופורציה במיכל התאוששות, המתת חסד דגים מראה סימנים של אי נוחות. יתר על כן, יש צורך בפועל את ההליך לפני התחלת ניסוי בקנה מידה גדול, כדי להבטיח זרימת עבודה שוטפת. במידת האפשר, בקש סיוע עם מילוי את המחטים אלקטרופורציה את עמית מספיק מיומן
שיטת חיסון DNA מאפשר עיצוב בהתאמה אישית של חיסון נגד אנטיגנים. זה אפשרי לשכפל כל אנטיגן או, עדיף, בחר חלקים של אנטיגן בהתבסס על לוקליזציה, immunogenicity הסלולר24. בנוסף, השיטה מאפשרת שילוב של מספר אנטיגנים או adjuvants לתוך חיסון אחד הבונה או מזריקים מספר פלסמידים נפרד באותו הזמן2. על ידי כולל של stop codon לאחר שרצף אנטיגן או excising את הגן EGFP מ פלסמיד, זה אפשרי לנצל את הווקטור פלסמיד אותו גם לבטא אנטיגן ללא תג N-מסוף GFP עוקבות. זה עשוי להיות סביר המאשרת את תוצאות חיוביות ההקרנה, ככל גדול יחסית לגודל GFP יכול להשפיע על קיפול של אנטיגן, לפיכך, להגביל את התגובות ההורמונאלית עורר פוטנציאלי מאת החיסון.
ביטוי אנטיגן גבוה יותר נקשר immunogenicity חיסון DNA2. אלקטרופורציה לאחר ההזרקה, ובכך, נכללה פרוטוקול זה, כפי הוכח להגדיל את הביטוי של אנטיגנים או הגנים כתב פי ארבעה ל tenfold ב דג זברה32. יתר על כן, אלקטרופורציה כמו טכניקה גורמת פגיעה רקמות מתון, ובכך וגורם לדלקת מקומית נוספת המקדם את החיסון-induced תגובות חיסוניות2. מצד שני, אלקטרופורציה היא בדרך כלל נסבל היטב. עם הציוד המשמש כאן, כמעט 100% של דג זברה למבוגרים יהיה לשחזר מנקודת מבט רעמי 40 V בשימוש בפרוטוקול הזה35שש.
בנוסף לשימוש אלקטרופורציה כדי לשפר את כניסתם של פלסמיד החיסון לתוך התאים, אנו משתמשים מקדם בכל מקום חזק את פלסמיד חיסון, זנב תיקים עשויים בקצה 3' של אנטיגן אנטיגן ההתבטאות בתאים transfected דגים. במקרים מסוימים, אם השימוש codon הפתוגן יעד שונה באופן משמעותי מן המינים חוסנו, אופטימיזציה codon נמצאה שימושית נוספת להגדיל את היעד גנים ביטוי2. במודל זה דג זברה -מ התחממות עולמית , עם זאת, codon אופטימיזציה אין השפעה משמעותית על רמות ביטוי גנים דגם mycobacterial שני, הדיור-6 ו- CFP-10, ו, לכן, שסברו מיותרים במודל זה35 .
היעד ביטוי גנים פרופילים יש גיוון טמפורלית בין האנטיגנים, בהתאם, למשל, את הגודל ואת המבנה של אנטיגנים המדובר. עם זאת, אנטיגן ביטוי דומה בדרך כלל בתוך קבוצה של דגים חיסון עם החיסון אותו. בדרך כלל, הביטוי EGFP הבהיר הוא ציין ארבעה ימים עד שבוע postvaccination, אך בקנה מידה 2 – 10 ימים אפשרית. מומלץ לאמת את הביטוי של כל חלבון כימרי אנטיגן-EGFP בקבוצה קטנה של דגים (2 – 3) לפני כולל אנטיגן בניסוי בקנה מידה גדול. אם אין ביטוי GFP נצפית בכל שלב 2 – 10 ימים לאחר חיסון, ודא כי 1) פרוטוקול חיסונים עקבו בזהירות. תמיד יש קבוצה של דגים חיסון עם פלסמיד pCMV ריק-EGFP כפקד חיובית, לוודא 2) אנטיגן ועיצוב שיבוט מולקולרי בוצע כראוי (פריימר נאותה עיצוב; אנטיגן התג EGFP הן של אותה מסגרת קריאה לא codons תפסיק להתערב הינם כלולים). במקרים מסוימים, למרות העיצוב הנכון אנטיגן, אין אפשרות לזהות GFP. זה יכול להיות בגלל שגוי קיפול או התמוטטות מהירה של החלבון פיוז'ן. בנסיבות אלה, ייתכן צורך לעצב מחדש אנטיגן.
בחיסונים המשמשים כדי לחסן את הדגים מעובדים, המינון פלסמיד בשימוש הוא µg בדרך כלל 1 או פחות33,7,34. בדג זברה, ביטוי גנים הכתב ניתן לזהות גם לאחר ההזרקה פלסמיד לפחות 0.5 µg בעקבות אלקטרופורציה; עם זאת, בביטוי הגן המטרה היחסית מגדיל באופן משמעותי עם כמות גבוהה יותר של פלסמיד לכל דג (משלים איור 1). בדגים הזריק פלסמיד כתב pCMV-EGFP, זריקה עם 5 – 20 µg של פלסמיד הביאו ארבע עד שמונה פעמים גבוה יותר EGFP רמות בהשוואה דגים הזריק 0.5 µg. לכן, כדי להבטיח ביטוי גנים יעד גבוה מספיק, עדיין יש אמצעי הזרקה קטן מספיק (≤7 µL) כדי למנוע נזק לרקמות עודף או דליפה חיסון, בחרנו להשתמש 5 עד 12 µg לכל דג לצורך סינון ראשוני. בנוסף חיסון immunogenicity, גבוה מספיק היעד גנים נדרש לזהות ביטוי גנים כתב עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות ועם תספיג חלבון, אשר הוא הכרחי עבור הקרנת למטרות לאשר הנכון אין ויוו תרגום של אנטיגן מטרה. עם זאת, פלסמיד נמוך במינונים (0.5-1 µg) יכול להיות שימושי עבור סוגים אחרים של שימוש ניסיוני.
לסיכום, פרוטוקול זה עבור החיסונים של דג זברה למבוגרים עם פלסמיד ה-DNA ניתן להשתמש בבדיקת פרה המועמדים הרומן חיסון נגד זיהומים שונים חיידקי או ויראלי. הביטוי של אנטיגן חיסון כמו חלבון ה-GFP-fusion מאפשרת את החזיית אירוע מוצלח התחסנות והביטוי אנטיגן. אנו מיישמים שיטה זו להקרנה פרה של מועמדים אנטיגן הרומן חיסון נגד שחפת. בשביל זה, אנו להדביק את postvaccination חמישה שבועות דג זברה, לקבוע שבקטריאלי שחשוב במערכת כל דג עם20,qPCR24.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים לחברי קבוצת המחקר אימונולוגיה ניסיוני, במיוחד על לינה Mäkinen, Hannaleena Piippo, על כל העבודה שהם עשו לפיתוח, אופטימיזציה של פרוטוקול חיסון, ולעזור שלהם ניסויים בפועל באמצעות הפרוטוקול.
עבודה זו נתמכה על ידי ג'יין יה Aatos Erkon Säätiö (ג'יין וקרן Erkko Aatos; כדי M.R.), סיגריד Juséliuksen Säätiö (קרן Juselius סיגריד; M.R.), תחרותי מצב המחקר המימון של אזור מומחה אחריות של אוניברסיטת טמפרה בית החולים (כדי M.R.), Tampereen Tuberkuloosisäätiö (קרן שחפת טמפרה; M.R., H.M., ואת M.N.), Suomen Kulttuurirahasto (קרן התרבות הפינית; H.M.), Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö (אנטי-שחפת פינית קרן; כדי H.M.), Väinö יה לליינה Kiven säätiö (Väinö וקרן קיוי לליינה; כדי M.N.) ושל קרן המדע העיר טמפרה (כדי M.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCMV-GFP plasmid | Addgene | #11153 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475-2L | DNA extraction |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166-5G | |
| Chloroform | Merck | 1.02445.2500 | DNA extraction |
| ECM Electro Square Porator | BTX Harvard apparatus | BTX ECM 830 | |
| FastPrep-24 5G | MP Biomedicals | 116005500 | homogenizer |
| Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | Pulling of needles |
| GeneJet PCR Purification kit | ThermoFischer Scientific | K0701 | |
| GFP ELISA kit | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
| Guanidine thiocyanate (FW 118.2) | Sigma-Aldrich | G9277-500G | DNA extraction |
| ImageJ2 | imagej.net/Downloads | freely available software | |
| LB Agar | Sigma | L2897-1kg | |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1kg | |
| Micromanipulator | Narishige | MA-153 | |
| Microscope | Nikon | AZ100 | fluorescense microscope |
| Microscope | Olympus | ZS61 | |
| Nightsea Full adapter system w/Royal Blue Color light head | Electron Microscopy Sciences | SFA-RB | |
| PBS tablets | VWR Chemicals | E404-200TABL. | |
| Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | 114537-5G | |
| PV830 Phneumatic Pico Pump | WPI | SYS-PV830 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi kit | Qiagen | ID:12163 | plasmid extraction |
| Sodium citrate (FW294.1) | VWR Chemicals | 27833.294 | DNA extraction |
| Tri Reagent | Molecular Research Center, Inc. | TR 118 | DNA extraction |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma | A5040-100g | anestesia and euthanasia solution |
| Tris (free base) (FW121.14) | VWR Life Science | 0497-500G | DNA extraction |
| Tweezertrodes Electrodes (7 mm) Kits | BTX Harvard apparatus | BTX 450165 | tweezer type electrodes |
| 2.8 mm Ceramic beads | Omni International | 19-646-3 | DNA extraction |
| 2 mL Tough tubes with caps | Omni International | 19-649 | DNA extraction |
| Aluminosilicate capillaries | Harvard apparatus | 30-0108 | |
| Microloader 20 µL | eppendorf | 5242956.003 | loading tips |
| Petri dishes, 16 mm | Sarsted | 82.1473 | |
| Scalpels | Swan Morton | 0501 | |
| Parafilm | Bemis | laboratory film | |
| Pins | |||
| Plastic spoon | |||
| Spatula | |||
| Sponge | |||
| Styrofoam workbench | |||
| Tweezers |
References
- Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356 (6365), 152-154 (1992).
- Tregoning, J. S., Kinnear, E. Using Plasmids as DNA Vaccines for Infectious Diseases. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
- Evensen, O., Leong, J. A. DNA vaccines against viral diseases of farmed fish. Fish Shellfish Immunology. 35 (6), 1751-1758 (2013).
- Sommerset, I., Lorenzen, E., Lorenzen, N., Bleie, H., Nerland, A. H. A DNA vaccine directed against a rainbow trout rhabdovirus induces early protection against a nodavirus challenge in turbot. Vaccine. 21 (32), 4661-4667 (2003).
- Li, L., Petrovsky, N. Molecular mechanisms for enhanced DNA vaccine immunogenicity. Expert Review of Vaccines. 15 (3), 313-329 (2016).
- Embregts, C. W. E., et al. Intramuscular DNA Vaccination of Juvenile Carp against Spring Viremia of Carp Virus Induces Full Protection and Establishes a Virus-Specific B and T Cell Response. Frontiers in Immunology. 8, 1340 (2017).
- Lorenzen, N., LaPatra, S. E. DNA vaccines for aquacultured fish. Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics). 24 (1), 201-213 (2005).
- Oksanen, K. E., et al. An adult zebrafish model for preclinical tuberculosis vaccine development. Vaccine. 31 (45), 5202-5209 (2013).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), (2004).
- Cho, J. H., Youn, J. W., Sung, Y. C. Cross-priming as a predominant mechanism for inducing CD8(+) T cell responses in gene gun DNA immunization. The Journal of Immunology. 167 (10), 5549-5557 (2001).
- Lewis, K. L., Del Cid, N., Traver, D. Perspectives on antigen presenting cells in zebrafish. Developmental & Comparative Immunology. 46 (1), 63-73 (2014).
- Shao, T., et al. Characterization of surface phenotypic molecules of teleost dendritic cells. Developmental & Comparative Immunology. 49 (1), 38-43 (2015).
- Utke, K., et al. Cell-mediated immune responses in rainbow trout after DNA immunization against the viral hemorrhagic septicemia virus. Developmental & Comparative Immunology. 32 (3), 239-252 (2008).
- Cuesta, A., et al. An active DNA vaccine against infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) with a different mode of action than fish rhabdovirus DNA vaccines. Vaccine. 28 (19), 3291-3300 (2010).
- Castro, R., et al. DNA vaccination against a fish rhabdovirus promotes an early chemokine-related recruitment of B cells to the muscle. Vaccine. 32 (10), (2014).
- Iwanami, N. Zebrafish as a model for understanding the evolution of the vertebrate immune system and human primary immunodeficiency. Experimental Hematology. 42 (8), 697-706 (2014).
- Patterson, H., et al. Adult zebrafish model of bacterial meningitis in Streptococcus agalactiae infection. Developmental & Comparative Immunology. 38 (3), 447-455 (2012).
- Cronan, M. R., Tobin, D. M. Fit for consumption: zebrafish as a model for tuberculosis. Disease Model & Mechanisms. 7 (7), 777-784 (2014).
- Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).
- Parikka, M., et al. Mycobacterium marinum causes a latent infection that can be reactivated by gamma irradiation in adult zebrafish. PLoS Pathogens. 8 (9), e1002944 (2012).
- Rounioja, S., et al. Defense of zebrafish embryos against Streptococcus pneumoniae infection is dependent on the phagocytic activity of leukocytes. Developmental & Comparative Immunology. 36 (2), 342-348 (2012).
- Myllymaki, H., Bauerlein, C. A., Ramet, M. The Zebrafish Breathes New Life into the Study of Tuberculosis. Frontiers in Immunology. 7, 196 (2016).
- Myllymaki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., Ramet, M. Animal models in tuberculosis research - where is the beef? Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).
- Myllymaki, H., et al. Identification of novel antigen candidates for a tuberculosis vaccine in the adult zebrafish (Danio rerio). PLoS One. 12 (7), e0181942 (2017).
- Myllymaki, H., Niskanen, M., Luukinen, H., Parikka, M., Ramet, M. Identification of protective postexposure mycobacterial vaccine antigens using an immunosuppression-based reactivation model in the zebrafish. Disease Model & Mechanisms. 11 (3), (2018).
- Ingolotti, M., Kawalekar, O., Shedlock, D. J., Muthumani, K., Weiner, D. B. DNA vaccines for targeting bacterial infections. Expert Review of Vaccines. 9 (7), 747-763 (2010).
- Kozak, M. Recognition of AUG and alternative initiator codons is augmented by G in position +4 but is not generally affected by the nucleotides in positions +5 and +6. The EMBO Journal. 16 (9), 2482-2492 (1997).
- Matthews, M., Varga, Z. M.
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies? Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
- Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-type response associates with restricted bacterial growth in latent mycobacterial infection of zebrafish. PLoS Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
- Rao, N. M., Rambabu, K. M., Rao, S. H.
- McCaffrey, J., Donnelly, R. F., McCarthy, H. O. Microneedles: an innovative platform for gene delivery. Drug Delivery and Translational Research. 5 (4), 424-437 (2015).
- Lorenzen, E., Lorenzen, N., Einer-Jensen, K., Brudeseth, B., Evensen, O. Time course study of in situ expression of antigens following DNA-vaccination against VHS in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum) fry. Fish and Shellfish Immunology. 19 (1), 27-41 (2005).
- Oksanen, K. Adult Zebrafish Model for Studying DNA-based Vaccination against Mycobacterial Disease. Tampereen yliopisto. , Tampere, Finland. (2011).
