Summary
Aquí se describe un protocolo para la inmunización del adulto pez cebra (Danio rerio) con una vacuna de ADN y demostrar la validación de un evento de éxito de la vacunación. Este método es adecuado para la investigación preclínica de candidatos vacunales en varios modelos de infección.
Abstract
Durante las últimas dos décadas ha aumentado el interés en la vacunación basada en ADN. Vacunación de ADN se basa en la clonación de una secuencia de un antígeno seleccionado o una combinación de antígenos en un plásmido, que permite un diseño a medida y seguro. La administración de las vacunas de ADN en las células del huésped conduce a la expresión de los antígenos que estimulan las respuestas inmunitarias humorales y mediada por células. Este informe describe un protocolo para la clonación de secuencias de antígeno en el plásmido pCMV-EGFP, la inmunización del pez cebra adulto con los candidatos de vacuna intramuscular microinyección y la electroporación posterior para mejorar la ingesta. Los antígenos de la vacuna se expresaron como proteína fluorescente verde (GFP)-proteínas de fusión, que permite la confirmación de la expresión de antígeno bajo UV luz de peces vivos y la cuantificación de los niveles de expresión de la proteína de fusión con ELISA, así como su detección con un análisis de western blot. El efecto protector de los candidatos a la vacuna es probado por infectar a los peces con Mycobacterium marinum postvaccination de cinco semanas, seguido de la cuantificación de las bacterias con qPCR cuatro semanas más tarde. En comparación con modelos de investigación preclínica mamíferos, este método proporciona un método rentable para la selección preliminar de candidatos vacuna DNA-basada novela contra una infección por micobacterias. El método puede aplicarse más a la detección basada en ADN vacunas contra diversas enfermedades bacterianas y virales.
Introduction
Los primeros estudios de vacuna de ADN fueron realizados en el decenio de 19901, y desde entonces, se han probado vacunas de ADN contra diversas enfermedades infecciosas, cáncer, autoinmunidad y alergia2. En los mamíferos, una vacuna de ADN contra el virus del Nilo occidental en caballos y una vacuna terapéutica de cáncer para el melanoma oral canina han sido autorizados, pero estos no están actualmente en uso clínico2. Además del interés por estudios de mamíferos, vacunación de ADN resultó para ser una forma conveniente para vacunar peces cultivados contra enfermedades virales. Una vacuna contra el virus de la necrosis hematopoyética infecciosa de peces (IHNV) ha estado en uso comercial desde 2005, y una vacuna contra el virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) fue recientemente con licencia3. Además, se están desarrollando varias vacunas de ADN contra patógenos de peces.
Como las vacunas tradicionales suelen contengan patógenos atenuados inactivados o vivo, que suponen un riesgo potencial de transmisión de la enfermedad2. Las vacunas de ADN, a su vez, evitar este riesgo, ya que se basan en la administración de plásmidos que codifican antígenos bacterianos o virales, más que el patógeno entero sí mismo2,4. Las vacunas de ADN son producidas con técnicas de recombinación de ADN, que permite el diseño exacto de los antígenos de la vacuna y la formulación flexible de combinaciones de antígenos y adyuvantes en una sola vacuna construcción5. Además, la producción de vacunas de ADN es más rápido, más fácil y más rentable que el de vacunas recombinantes basados en proteínas, que es una gran ventaja para el candidato de vacuna con fines de detección, sino también, por ejemplo, en el caso de brotes de pandemia 2.
En los peces, las rutas de administración más común para las vacunas de ADN son intraperitoneal, intramuscular y oral3,6,7, mientras que en los mamíferos, subcutáneo y vías intradérmicas son opciones adicionales2. Después de una inyección intramuscular, la plásmidos de ADN administrada entrar las células en el sitio de administración (por ej., en su mayoría miocitos, pero también células presentadoras de antígeno residente [CPA]). La proporción de células transfected puede incrementarse significativamente por electroporación2,8. Después de entrar en la célula, algunos plásmidos ADN entra en el núcleo, donde los genes codificados por el plásmido son transcrito2. En este protocolo, utilizamos el plásmido pCMV-EGFP que tiene un fuerte promotor omnipresente optimizado para expresión eucariotas9. En esta construcción, los antígenos se traducen como una proteína de fusión con un GFP. La GFP permite la confirmación de una vacunación exitosa y el producto correcto de antígeno por la simple visualización de la expresión del antígeno con un microscopio de fluorescencia en peces vivos.
En los mamíferos, las vacunas de ADN han demostrado estimular diferentes tipos de respuestas inmunitarias dependiendo de los tipos de células transfected2,5. Miocitos transfected secretan antígenos en el espacio extracelular o liberan a la muerte celular, y posteriormente, los antígenos por CPA presentan el complejo mayor de histocompatibilidad II moléculas2. Esto desencadena las respuestas de la célula CD4 y T CD8, sobre todo, además de las respuestas de la célula de B2,5,10. En los peces, los linfocitos T y B, así como las células dendríticas (DCs), han sido identificadas, sin embargo, su división del trabajo en la presentación del antígeno es menos bien entendida11. DCs de pez cebra, sin embargo, han demostrado compartir conservadas características fenotípicas y funcionales con sus homólogos mamíferos12. Además, la vacunación de la DNA ha demostrado que provocan respuestas inmunes similares en peces y en mamíferos, incluyendo células B y T respuestas6,13,14,15,16 .
Larvas y pez cebra adulto son ampliamente utilizados para el modelo de distintas enfermedades infecciosas, como el modelo de infección de M. marinum de pescado de tuberculosis utilizado en este protocolo17,18,19,20 ,21,22. En comparación con organismos de mamíferos modelo, las ventajas del pez cebra incluyen su pequeño tamaño, rápida reproducibilidad y bajo vivienda gastos23. Estos aspectos hacen del pez cebra un modelo animal ideal para estudios de investigación preclínica a gran escala de nuevas vacunas y compuestos farmacéuticos23,24,25.
En este protocolo, describimos cómo novela antígeno vacunal candidatos contra Micobacteriosis pueden evaluarse por la vacunación DNA-basada de pez cebra adulto. En primer lugar, describimos cómo se clonan los antígenos en el plásmido de expresión pCMV-EGFP, seguido de un protocolo detallado para la inyección intramuscular de vacuna plásmidos y la electroporación posterior en músculo. La expresión de cada antígeno es confirmada por posinmunización de una semana de la microscopia de fluorescencia. La eficacia de los candidatos de antígeno luego es probada por experimentalmente infectando peces vacunados con M. marinum.
Protocol
Experimentos como el pez cebra adulto requieren un permiso para la experimentación animal para la vacunación y los estudios posteriores con el modelo de infección. Todos los métodos y experimentos descritos aquí son aprobados por la Junta Directiva de experimento de Animal de Finlandia (ESAVI) y los estudios se realizan conforme EU Directiva 2010/63/UE.
1. clonación de antígenos de vacuna de ADN
- Seleccione un plásmido de expresión optimizado para la eucariota expresión de antígenos de interés bajo un promotor fuerte, constitutivo, como el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV). Para habilitar la comprobación en vivo de la expresión del antígeno, seleccione un plásmido de vacuna que codifica una etiqueta fluorescente, como el pCMV-EGFP plásmido9 utilizado en este protocolo.
- Utilizar herramientas basadas en web y bioinformáticas adecuadas para seleccionar una secuencia potencialmente protección inmune antígeno o varias secuencias de aproximadamente 90 – 600 nt (aa 30 – 200)26 de los genes-de-interés del patógeno que se utilizarán en la modelo de infección subsecuente.
- Usar software disponible, o manualmente diseño de cebadores para amplificar los genes del antígeno desde el genoma del patógeno y clonación de las secuencias del antígeno en el sitio de clonación múltiple del plásmido de expresión. Asegúrese de conservar el marco de lectura correcta al seleccionar el antígeno.
- Incluyen una secuencia (CCACC) Kozak del27 y un codón de inicio (ATG) en el primer 5'. Para conservar la etiqueta C-terminal EGFP, evitar intervención codones de parada (TAA, TAG, TGA) en la secuencia del antígeno y el primer 3'. Además, asegúrese de que la etiqueta GFP permanece en el mismo marco de lectura con el antígeno de interés.
- Utilizar ARN o del ADN extraído de patógeno como plantilla para generar una cantidad adecuada del producto de PCR con los iniciadores de la clonación. Utilice preferentemente, una ADN polimerasa revisión para preservar la secuencia del antígeno correcto.
- Purificar el producto PCR y verificar el tamaño correcto del producto por electroforesis en gel. Digerir y ligar el producto PCR con el plásmido digerido la vacuna.
- La combinación de ligadura se transforman en células bacterianas competentes según un protocolo adecuado. Utilizar una selección apropiada de antibióticos para las colonias positivas y la producción del plásmido en e. coli; el plásmido pCMV-EGFP, por ejemplo, contiene un gen de resistencia a la ampicilina para esto.
- Uso de Sanger secuenciación para confirmar la inserción de la secuencia del antígeno correcto. Los iniciadores siguientes pueden utilizarse para antígenos de secuenciación en el plásmido pCMV-EGFP: adelante de CMV 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3 'y EGFP-N atrás 5' CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG 3'.
- Producir y purificar una cantidad suficiente de la construcción de la vacuna. Disolver o eluir el plásmido en agua estéril. Asegúrese de que el ADN plásmido producido es de alta calidad y la concentración es al menos 0.72 μm o 2.000 ng/μl.
2. tirar las agujas de microinyección
- Prepara con antelación las agujas de la microinyección. Utilice capilares de vidrio de aluminosilicato de 10 cm. Tenga en cuenta que Capillares de vidrio de borosilicato son demasiado frágiles para la inyección de peces adultos.
- Tire las agujas con un dispositivo de fabricación de la aguja de una micropipeta.
Nota: Las agujas deben asemejarse a la que se presenta en la figura 1. Con el dispositivo usado en este protocolo (Tabla de materiales), los siguientes ajustes de resultan en el tipo deseado de agujas:- Defina el vidrio capilar en la ranura en V en la barra del extractor y apriete la perilla de fijación ligera.
- Mueva el soporte al lado del filamento y empuje suavemente el tubo capilar a través del filamento en la barra del extractor en el otro lado del filamento. Evite tocar el filamento con el tubo capilar.
- Apriete las perillas de sujeción establecidos el cristal de seguridad y pulse el botón de extracción.
PRECAUCIÓN: El filamento está caliente.
- Colocar las agujas en un pedazo de adhesivo reutilizable dentro de una placa de Petri 15 cm para proteger las puntas de aguja. Mantener el plato cubierto para limpiar las agujas.
3. llenar las agujas de la micropipeta
- Preparar la mezcla de la vacuna. Utilizar 0,5 – 12 μg de plásmido por dosis. Si la combinación de varios plásmidos diferentes en la combinación de una vacunación, utilizar una concentración de DNA total máxima de 12 μg por pescado.
- Calcular el volumen de la vacuna contra la "master mix" según el número de peces en cada grupo (véase abajo). Añadir 1 μl de rojo de fenol estéril filtrada a cada dosis de inyección para aliviar tanto el relleno de las agujas del capilares y la observación de la inyección. Añadir estéril 1 x PBS hasta un volumen máximo total de 5 – 7 μL en una inyección dosis8.
Nota: Volúmenes de inyección superiores a 7 μl pueden resultar en la salida ocasional de la solución de la inyección y por lo tanto, deben evitarse. - Coloque un pedazo de cinta adhesiva, pegamento hacia arriba, sobre un soporte apropiado, por ejemplo, al lado de una caja vacía de punta. Suavemente Coloque las agujas capilares a la cinta.
- Pipeta de un máximo de 7 μl de la mezcla de la vacuna en un pedazo de película de laboratorio. Usando una punta de carga, transferencia de la vacuna de la película dentro de la aguja. Pipeta lentamente y con cuidado, evitar pipetear las burbujas de aire en la aguja.
- Dejar las agujas reposar 15-30 min eliminar posibles restantes pequeñas burbujas de aire.
4. Ajuste de la microinyectora y Electroporator para la inmunización
- Coloque el instrumental quirúrgico y una fuente de luz en la posición correcta. Cambiar la llave de la presión de aire a la posición abierta.
- Ajustar los parámetros para el neumático de la bomba (vea la figura 2) como sigue.
- Gire la perilla de ventilación en el Puerto de expulsión para sostener para evitar el rellenado de la pipeta por la acción capilar. Establecer la tubería desde el puerto de expulsión en la micropipeta. No use el puerto de vacío en el presente Protocolo.
- Ajustar la longitud del pulso: utilizar el tiempo modo, que un temporizador electrónico controla la duración del tiempo el solenoide de presión permanece abierto. Compruebe que la lámpara verde próxima al manómetro Eject se ilumina cuando el solenoide de presión está abierta (energizado).
- Establece el rango del pulso en 10 s; con esta configuración, los pulsos pueden ser más fijados de 100 ms para uso s. 10.1 el período 10-vuelta dial para ajustar la longitud del pulso, cada giro de la esfera es de 1,0 s. Si es necesario, esto también se puede ajustar durante una inyección.
- Utilice el iniciador de impulsos ("botón Inicio") en el panel frontal de la bomba neumática, o un control remoto del interruptor de pie (recomendado). Esto está conectada a la parte frontal de la bomba neumática.
- Ponga la aguja en el soporte de una micropipeta de las amalgamas dentales. Cortar la punta de la aguja con las pinzas para que el líquido puede ser expulsado y utilizar el microscopio para ver la posición correcta. Pulse el interruptor de pie una vez para ver que un pulso de 1 s empuja una pequeña gota de la aguja.
- Utilice la siguiente configuración para el electroporator: voltaje = 40 V; longitud de pulso = 50 ms, número de pulsos = 6. Conectar las pinzas a la electroporator. Ver que la tensión real y la longitud del pulso que se muestra en el monitor no difieren significativamente de los valores.
5. inyección de la vacuna de ADN y electroporación
- De vacunas según este protocolo, uso saludable, 6 a 12 meses adulto pez cebra. Mantener los peces en un sistema de flujo con un ciclo de 14/10 h luz/oscuridad, con un máximo de siete peces por 1 L de agua.
- Preparar una 0.02% 3-aminobenzoico ácido etil ester (Metanosulfonato) solución (pH 7) en el agua del tanque para anestesiar el pez28. Use un plato de Petri de 10 cm o algo similar.
- Preparar un tanque de recuperación llenando un vaso de precipitados de 5 L con 3 L de agua limpia del sistema.
- Preparar una relleno para mantener el pescado en una posición fija durante la vacunación la vacunación. Tomar un trozo de2 cm 5 x 7 de 2 a 3 cm de grosor esponja. Cortar un surco en la esponja con una hoja de bisturí o tijera afi lada.
Nota: El relleno mismo de vacunación puede utilizarse en múltiples experimentos. Desinfectar la esponja entre los experimentos sumergiéndolos en alcohol etílico al 70% y dejar para secar. - Bien empape la esponja en el agua del sistema y la esponja en un plato de Petri.
- Rápido el pescado 24 h antes de la vacunación.
- Anestesiar un pez cebra colocando en una placa Petri que contiene 0,02% de Metanosulfonato. Espere hasta que el pescado no responde al tacto estimulación y hasta que no haya ningún movimiento de las branquias. Anestesiar un pez solo en un momento.
- Usando una cuchara de plástico, transferir el pez cebra anestesiado en la esponja mojada y establecer el lado ventral del pez en la ranura. En la posición correcta, asegúrese de que la cabeza y la mayor parte del cuerpo de los peces está dentro de la ranura y la aleta dorsal y la cola son sobresalga de la ranura.
- Bajo el microscopio, coloque cuidadosamente la aguja en un ángulo aproximado de 45° cerca de músculo dorsal del pez cebra, mediante los ejes x y y ajuste de las ruedas en el micromanipulador.
- Encontrar el lugar pequeño sin escamas delante de la aleta dorsal, que empuja la aguja no exige fuerza. Si se siente resistencia, probar el punto adyacente. Evitar lesiones de la espina dorsal, la aleta dorsal o las escalas.
Nota: Si la aguja se dobla mientras empuja, acortar la aguja ligeramente cortándolo. - Utilice el interruptor de pie para poco a poco inyecte la solución de la vacuna en el músculo. Observar la inyección a través del microscopio: rojo de fenol es visible al entrar en el tejido muscular. Ajuste la duración del pulso si es necesario.
Nota: Como alternativa, utilice el botón iniciador en el panel frontal de la bomba neumática para la inyección. Sin embargo, el uso de un interruptor de pedal remoto permite utilizar la otra mano para ajustar la longitud del pulso de la rueda 10-dé vuelta al dial. Evitar inyectar la solución demasiado rápida, ya que esto puede causar daño tisular excesiva. Asegúrese de no inyectar aire. - Electroporate el pescado inmediatamente después de la inyección. Asegúrese de que el pez es todavía bajo anestesia. Mantener el pez en la esponja y establecer el pescado entre electrodos tipo pinza, para que los electrodos están situados a cada lado del sitio de inyección. No presione demasiado las pinzas electrodo pero mantener ambos electrodos en contacto con el pescado.
- Presione el botón start en el electroporator darle 40 V, pulsos de 50 ms de seis.
- Transferir suavemente el pescado para el tanque de recuperación.
- Limpie los electrodos después de cada electroporación por birlar con etanol al 70%.
Nota: Vigilar cuidadosamente el bienestar de los peces después de la vacunación. Eutanasia cualquier pez mostrando signos de malestar (una lenta recuperación de la anestesia, aberrante natación, jadeo) en Metanosulfonato de 0.04%. Después de la recuperación, transferir el pescado a la unidad de flujo y aliméntelo normalmente.
6. visualización y proyección de imagen de la expresión del antígeno
- Anestesiar a los peces Metanosulfonato de 0.02% 2 – 7 días después de la inmunización y usar una luz UV para ver la expresión de EGFP cerca del sitio de inyección.
Nota: Inspección Visual bajo luz UV es una operación fácil y no invasivo que es conveniente para la verificación rutinaria de vacunas exitosas, también en experimentos a gran escala. Si no hay imágenes de los peces están necesarios, este paso puede realizarse también en los tanques de pescados regulares sin necesidad de anestesiar o mover los peces. - Para capturar imágenes, usar un microscopio de fluorescencia para visualizar la expresión de EGFP en el sitio de inyección8. Use una lente de objetivo 2 X y seleccionar el filtro correcto para visualizar la fluorescencia u opiniones de la luz visibles.
- Mantenga el pez anestesiado aún presionando la aleta ventral suavemente con las pinzas hacia la parte inferior de una placa de Petri. Tomar imágenes de microscopio de luz y fluorescencia de la misma zona.
- Fusionar las imágenes de microscopio de luz y fluorescencia usando el software apropiado29. Agrega una barra de escala.
7. cuantificación de la expresión a nivel y tamaño de los antígenos
- Eutanasia a los peces Metanosulfonato de 0.04%. Disecar la parte fluorescente del músculo dorsal con un bisturí y pinzas bajo luz UV. Extracto de proteínas de muestras8.
- Verifique el tamaño correcto de en vivo-produce las proteínas con un análisis de western blot, usando una peroxidasa de rábano (HRP)-anticuerpo conjugado de GFP (o similar)8. Incluir un control negativo (pescado no están vacunado) para excluir cualquier señales de fondo y vinculante, junto con un control que expresan EGFP sin un antígeno fusionado.
Nota: Para el análisis de western blot, el tamaño esperado (en kDa) de las proteínas de fusión con el antígeno se puede calcular, por ejemplo, por la ecuación:
Peso molecular (MW) de dsDNA = (número de nucleótidos x 607.4) + 157.9; o mediante el uso de herramientas basadas en web. - Cuantificar la expresión de cada antígeno utilizando un GFP-ELISA8 (opcional).
8. combinar el protocolo de vacunación con un modelo de infección de M. marinum
- Determinar el tamaño de grupo, necesario para la determinación fiable de la eficacia de un candidato de vacuna contra la novela en el modelo de infección y los análisis utilizados (véase, por ejemplo, Myllymaki et al. 24 y Charan y Kantharia30). Realizar los cálculos de energía apropiada y planificación de los experimentos.
- Para evaluar la eficacia de las vacunas candidatas son, infectar el posinmunización de 5 semanas de pescado. Utilice una infección intraperitoneal con aproximadamente 30 unidades formadoras de colonias (UFC) de M. marinum, que conduce a una infección latente en la mayoría de los pescados8,20,31.
Nota: Cuando utilice el M. marinum, siga un protocolo de seguridad BSL2. La preparación de la bacteria o virus depende del patógeno. - Cuantificar el número de patógenos en cada pez. Eutanasia el postinfection de 4 semanas de peces y determinar la carga bacteriana en cada pescado de ADN extraído con qPCR utilizando primers específicos para M. marinum20,24.
Nota: Asegúrese de incluir un grupo control apropiado y utilizar los correctos métodos estadísticos para el análisis de los resultados. Generalmente, un grupo de peces vacunados con el plásmido pCMV-EGFP vacía es un conveniente control negativo. - Confirman resultados positivos con los antígenos sin la etiqueta GFP. Clonar los antígenos como se describe en el paso 1 y repita el experimento de la vacunación.
Representative Results
Los pasos involucrados en el protocolo de vacunación de la DNA del pez cebra adulto se ilustran en la figura 3. Al principio, las secuencias de antígeno seleccionado son clonadas en un plásmido de pCMV-EGFP y DNA plasmídico es producido y purificado24 (figura 3). Candidatos vacunales continuación se inyectan por vía intramuscular con una microinyectora y el sitio de inyección es electroporated para mejorar la entrada del plásmido en las células (figura 3). La dosis de la vacuna utilizada fue optimizada inyectando diferentes cantidades del plásmido pCMV-EGFP y midiendo la expresión de GFP con ELISA (suplementario figura 1). Dos a postvaccination de siete días, la expresión de la proteína de fusión se detecta bajo luz UV y visualizada con microscopía de fluorescencia (figura 3 y figura 4). Los niveles de expresión de distintos antígenos pueden variar de muy intensiva (antígeno 1) para una expresión débil (figura 4). Además, se observa expresión de GFP en el músculo dorsal (antígeno 1) o en un área más limitada (antígeno 2) (figura 4). Sin embargo, si no hay fluorescencia se detecta dentro de 10 días, se recomienda para asegurarse de que no hay errores en el diseño de clonación o cartilla de antígeno. Para confirmar que la proteína de fusión expresada es del tamaño correcto, proteínas pueden extraerse del tejido muscular alrededor del sitio de inyección y utilizadas para un análisis de western blot.
Se evaluó el efecto de los candidatos a vacuna desafiando el pescado con una dosis baja de M. marinum por inyección intraperitoneal (figura 5). Postinfection de cuatro a cinco semanas, los conteos bacterianos son fijados con qPCR y frente a las cargas bacterianas en el grupo control (figura 5). Además, la efectividad de los candidatos más prometedores de la vacuna puede ser probada mediante el control de la supervivencia después de una dosis alta de infección por M. marinum ()figura 5). Sin embargo, además de dar un resultado cuantitativo en la progresión de la infección, en vez de simplemente una condición de vivo o muerto, la cuantificación de UFC basada en qPCR requiere menos tiempo y tamaños más pequeños del grupo y es, por tanto, un enfoque más ético para una primaria pantalla. En general, este protocolo facilita la evaluación de la efectividad de los antígenos de la vacuna contra la novela dentro de 12 semanas (figura 5).
Figura 1: Primer plano (12 X) de agujas de aluminosilicato utilizado en las inyecciones intra muscular de pez cebra adulto. La punta de abajo se ha cortado con las pinzas y está lista para ser utilizado para microinyecciones. Esta figura ha sido adaptada de Oksanen35. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: equipo de microinyección y puesta en servicio. Los principales componentes de los equipos necesarios para la vacunación de la DNA del pez cebra adulto se destacan en negrita. Se indican los ajustes críticos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: preparación de la plásmidos de vacuna de ADN y el procedimiento de inmunización. Antígenos (1) seleccionado se clonan adyacente a la etiqueta GFP en el plásmido pCMV-EGFP. Construcción (2) la vacuna es producido microbiológicamente, concentrado y purificado. (3) 12 μg de plásmido se inyecta en el músculo dorsal de un pez cebra adulto anestesiado con un microinyector, y el sitio de inyección es posteriormente electroporated con seis pulsos de 50 ms de 40-V. (4) postvaccination de dos a siete días, la expresión de GFP de la proteína de la fusión de GFP de antígeno se visualiza con un microscopio de fluorescencia. (5) el fluorescente parte del músculo dorsal puede ser disecado y utilizado para la extracción de proteína. El tamaño de la proteína de fusión se confirma con un análisis de western blot y el nivel de expresión con ELISA de GFP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: visualización de la expresión de la proteína de fusión del antígeno-EGFP. Pez cebra adultos anestesiado son vacunados con 12 μg de antígenos de vacuna experimental (antígeno 1 – 3) y el sitio de inyección es electroporated, posteriormente, con seis 40 V, ms de 50 pulsos. Dos a postvaccination de siete días, el sitio de inyección es fotografiada con un microscopio. En primer lugar, la expresión de GFP se detecta con un microscopio de fluorescencia. El área es inspeccionado utilizando un objetivo de magnitud X 2 y reflejada y guardados en forma de TIFF. La imagen de microscopio de luz de la misma zona se combina con la imagen de la fluorescencia usando el software ImageJ. La cantidad y posición de la expresión de antígeno pueden variar entre antígenos y cada pez. Por ejemplo, la expresión del antígeno 1 se observa en el músculo dorsal y la expresión del antígeno 2 se ve como pequeños puntos, mientras que 3 el antígeno se expresa fuertemente en un área más limitada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: pruebas de la efectividad de los candidatos de vacuna contra una infección micobacteriológica. Pez cebra (1) adulto son vacunados con vacunas experimentales de ADN contra Micobacteriosis. (2) postvaccination de cinco semanas, los peces son infectados con una dosis baja del marinum de la micobacteria (~ 30 UFC). (3) cuatro semanas más tarde, el interno órganos disecados y utilizados para la extracción de ADN. (4) el recuento bacteriano de cada pescado se cuantifica con qPCR con M. marinum-iniciadores específicos. Inmunización con antígeno 1 condujo a una disminución significativa en los recuentos bacterianos (p < 0.01, ANOVA de dos vías), mientras que los antígenos 2 y 3 no tuvo efecto. Además se evaluó el efecto de (5) la protección del candidato más prometedor de la vacuna (antígeno 1) en un experimento de supervivencia, donde infectan a peces con una dosis alta (~ 10.000 UFC) de bacterias y su supervivencia es monitoreada durante 12 semanas. Consistente con la disminución de la carga bacteriana observada en el panel 4, vacuna con antígeno 1 también mejora la supervivencia de los peces a una infección de M. marinum (p < 0,01), lo que sugiere este antígeno podría ser un prometedor candidato para una nueva vacuna contra la tuberculosis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Suplementario Figura 1: cantidad de ADN plásmido afecta derivados del plásmido de expresión de EGFP en pez cebra adulto. Grupos de peces (n = 5 en cada grupo) fueron inyectados con 0.5 – 20 μg de pCMV-EGFP, y electroporación (seis pulsos de 50 V) fue utilizada para mejorar la transfección. Peces de control (CTRL) se inyectaron con 2 μg de plásmido pCMV vacío no contiene el gen EGFP. GFP-ELISA fue postinjection realizó 3 días para definir la expresión relativa de la EGFP en homogenados de pescado. Los valores de P: *p < 0,03, **p < 0,004. Las barras de error representan desviaciones estándar. NS = no significativo. Esta figura ha sido adaptada de Oksanen35. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
El procedimiento de inmunización de pez cebra adulto con vacunas basadas en ADN requiere algunos conocimientos técnicos. Incluso para un investigador experimentado, la vacunación de un pez solo toma aproximadamente 3 minutos, excluyendo preparaciones. Por lo tanto, un máximo de aproximadamente 100 peces puede aplicarse la vacuna dentro de un día. Si más de 100 peces se necesitan para el experimento, las vacunas se pueden dividir entre un máximo de 3 días. Además de la calidad de la experiencia, formación suficiente de los researcher(s) para el manejo de los peces y realizar la inmunización es esencial para el bienestar de los peces. Asegúrese de seguir las pautas y normas de bienestar animal y legal local cuando se trata de los peces, planificación de los experimentos y las condiciones requeridas para el personal llevar a cabo los experimentos de la vivienda.
En Resumen, hay varios pasos fundamentales para evitar complicaciones en el protocolo de vacunación. Para la inmunización exitosa, asegúrese de que 1) los peces a ser inmunizados son sanos y suficientes en edad y tamaño (puede requerir la inmunización de los peces más jóvenes abajo ampliar el volumen de vacuna y la configuración de electroporación); 2) los peces son anestesiados correctamente con no más fuerte que el éster de etilo ácido aminobenzoico 3 0.02%, y siguen siendo anestesiados a lo largo de todo el procedimiento (anestesia debe mantenerse tan corta como sea posible para garantizar la recuperación de los peces); 3) la boina de esponja se empapa bien; 4) líquido se inyecta en cada pulso de la bomba neumática y, si no, se ajusta la longitud del pulso (tirando de la aguja ligeramente hacia atrás a lo largo del eje y puede ayudar); 5) no hay ninguna burbuja de aire con la solución de la vacuna; 6) la configuración de electroporación y el voltaje del pulso real y la longitud son correctos; 7) los electrodos no hacen daño a la piel en el sitio de electroporación (durante la electroporación, guardar los electrodos en suave con con el pescado y soltar el pescado inmediatamente en el tanque de recuperación después de la electroporación).
Es importante vigilar el pescado después de la electroporación en el tanque de recuperación y eutanasia cualquier pez mostrando signos de malestar. Además, es necesario practicar el procedimiento antes de comenzar un experimento a gran escala, para asegurar un flujo de trabajo fluido. Si es posible, pedir a un compañero suficientemente entrenado ayuda con llenar las agujas y la electroporación.
El método de vacunación de ADN permite el diseño a la medida de los antígenos de la vacuna. Es posible clonar el antígeno entero o, preferiblemente, selecciona las partes del antígeno basados en la localización y la inmunogenicidad celular24. Además, el método permite la combinación de varios antígenos o adyuvantes en la construcción de una vacuna o inyección de varios plásmidos diferentes en el mismo tiempo2. Mediante la inclusión de un codón de parada después de la secuencia del antígeno o suprimiendo el gen EGFP de plásmido, es posible utilizar el mismo vector plásmido también para expresar el antígeno sin la etiqueta posterior de GFP N-terminal. Esto puede ser razonable para confirmar los resultados de la investigación positiva, como el tamaño relativamente grande de GFP puede afectar el plegamiento del antígeno y, por lo tanto, restringir las respuestas humorales potencialmente evocadas por la vacunación.
Una mayor expresión de antígeno se ha ligado a de inmunogenicidad de la vacuna de ADN2. Electroporación después de la inyección por lo tanto, se, ha incluido en este protocolo, como se ha demostrado para aumentar la expresión de antígenos o genes del reportero de cuatro a diez veces en el pez cebra32. Además, como una técnica de la electroporación provoca lesión moderada del tejido, así induciendo inflamación local que más promueve la respuesta inmune inducida por la vacuna2. Por otro lado, la electroporación es generalmente bien tolerada. Con el equipo utilizado aquí, prácticamente el 100% de pez cebra adulto recuperará bien a partir de los seis pulsos de 40 V utilizado en este protocolo35.
Además de la electroporación para aumentar la entrada del plásmido vacuna dentro de las células, utilizamos un fuerte promotor omnipresente en el plásmido de vacuna y cola polyA en el extremo 3' del antígeno para mejorar la expresión del antígeno en las células transfected pescado. En algunos casos, si el uso del codón del patógeno objetivo difiere significativamente de la especie vacunada, optimización de codón se ha encontrado útil en seguir incrementando el objetivo gene expression2. En este modelo de pez cebra -marinum del M. , sin embargo, codón optimización no tuvo efectos significativos sobre los niveles de expresión de dos genes de micobacterias modelo, ESAT-6 y CFP-10 y, por lo tanto, considerarse innecesaria en este modelo35 .
Perfiles de expresión génica de destino tienen alguna variación temporal entre los antígenos, dependiendo, por ejemplo, el tamaño y la estructura de los antígenos en cuestión. Sin embargo, la expresión del antígeno es generalmente similar dentro de un grupo de peces vacunados con la vacuna contra la misma. Por lo general, la más brillante expresión de EGFP se observa cuatro días a una semana postvaccination, pero una escala de 2 a 10 días es posible. Se recomienda validar la expresión de cada proteína de fusión del antígeno-EGFP en un pequeño grupo de peces (2-3) antes de incluir el antígeno en un experimento a gran escala. Si ninguna expresión de GFP se observa en cualquier punto de 2 – 10 días después de la inmunización, asegúrese de que 1) el protocolo de inmunización fue seguido cuidadosamente. Siempre tienen un grupo de peces vacunados con el plásmido pCMV-EGFP vacío como control positivo y asegúrese de que 2) el diseño de antígeno y la clonación molecular se llevó a cabo correctamente (primer adecuado diseño, el antígeno y la etiqueta EGFP son ambos en el mismo marco de lectura y no interviniendo codones de parada son incluidos). En algunos casos, a pesar del diseño de antígeno correcto, no puede detectarse GFP. Esto puede ser debido al plegamiento incorrecto o avería rápida de la proteína de fusión. En estas circunstancias, puede ser necesario rediseñar el antígeno.
En las vacunas que se utilizan para vacunar peces cultivados, la dosis de plásmido utilizada es típicamente 1 μg o menos de33,7,34. En el pez cebra, expresión del gen reportero puede también detectarse después de por lo menos una inyección de 0,5 μg plásmido siguiente electroporación; sin embargo, la expresión del gen objetivo relativo aumenta significativamente con una mayor cantidad de plásmido por pescado (suplementario Figura 1). En peces inyectados con el plásmido reportero de pCMV-EGFP, una inyección con 5-20 μg de plásmido resultó en cuatro a ocho veces mayor EGFP niveles en comparación con peces inyectados con 0,5 μg. Por lo tanto, para garantizar una expresión del gen objetivo bastante alto, sin embargo, tienen volúmenes de inyección que son lo suficientemente pequeño (≤7 μL) para prevenir cualquier daño de exceso de tejido o la salida de la vacuna, hemos optado por utilizar 5 a 12 μg / pez para los fines de la investigación preliminar. Además de inmunogenicidad de la vacuna, un alto suficiente expresión del gen objetivo es necesaria para detectar la expresión del gen reportero con un microscopio de fluorescencia y western blot, que es necesario para la detección de efectos para confirmar el correcto en vivo traducción del antígeno blanco. Sin embargo, plásmido menor dosis (0,5 – 1 μg) puede ser útil para otros tipos de usos experimentales.
En conclusión, este protocolo para la inmunización de pez cebra adulto con un plásmido de ADN puede utilizarse en las pruebas preclínicas de los candidatos de nueva vacuna contra varias infecciones virales o bacterianas. La expresión del antígeno de la vacuna como una proteína de la fusión de GFP permite la visualización de una expresión de antígeno y el evento de inmunización exitosa. Aplicamos este método para la investigación preclínica de los candidatos de antígeno de nueva vacuna contra la tuberculosis. Para ello, infectar el postvaccination de cinco semanas de pez cebra y determinar que el bacteriano cuenta en cada pescado con qPCR20,24.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores están agradecidos a los miembros del grupo de investigación de Inmunología Experimental, y especialmente a Leena Mäkinen y Hannaleena Piippo, por todo el trabajo que han hecho en el desarrollo y optimización del Protocolo de vacunación y su ayuda en experimentos reales utilizando el protocolo.
Este trabajo fue apoyado por Jane ja Aatos Erkon Säätiö (Jane y Aatos Erkko Fundación; a M.R.), Sigrid Juséliuksen Säätiö (Sigrid Juselius Fundación; a M.R.), el financiamiento competitivo de investigación estado de la zona de responsabilidad de expertos de la Universidad de Tampere Hospital (M.R.), Tampereen Tuberkuloosisäätiö (Fundación de Tuberculosis de Tampere a M.R., H.M. y M.N.), Suomen Kulttuurirahasto (Finnish Cultural Foundation; a su Majestad), Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö (finlandesa contra la Tuberculosis Fundación; a H.M.), Väinö ja Laina Kiven säätiö (Väinö y Laina Kivi Fundación; a M.N.) y la Fundación de Ciencias de la ciudad de Tampere (en M.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCMV-GFP plasmid | Addgene | #11153 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475-2L | DNA extraction |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166-5G | |
| Chloroform | Merck | 1.02445.2500 | DNA extraction |
| ECM Electro Square Porator | BTX Harvard apparatus | BTX ECM 830 | |
| FastPrep-24 5G | MP Biomedicals | 116005500 | homogenizer |
| Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | Pulling of needles |
| GeneJet PCR Purification kit | ThermoFischer Scientific | K0701 | |
| GFP ELISA kit | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
| Guanidine thiocyanate (FW 118.2) | Sigma-Aldrich | G9277-500G | DNA extraction |
| ImageJ2 | imagej.net/Downloads | freely available software | |
| LB Agar | Sigma | L2897-1kg | |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1kg | |
| Micromanipulator | Narishige | MA-153 | |
| Microscope | Nikon | AZ100 | fluorescense microscope |
| Microscope | Olympus | ZS61 | |
| Nightsea Full adapter system w/Royal Blue Color light head | Electron Microscopy Sciences | SFA-RB | |
| PBS tablets | VWR Chemicals | E404-200TABL. | |
| Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | 114537-5G | |
| PV830 Phneumatic Pico Pump | WPI | SYS-PV830 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi kit | Qiagen | ID:12163 | plasmid extraction |
| Sodium citrate (FW294.1) | VWR Chemicals | 27833.294 | DNA extraction |
| Tri Reagent | Molecular Research Center, Inc. | TR 118 | DNA extraction |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma | A5040-100g | anestesia and euthanasia solution |
| Tris (free base) (FW121.14) | VWR Life Science | 0497-500G | DNA extraction |
| Tweezertrodes Electrodes (7 mm) Kits | BTX Harvard apparatus | BTX 450165 | tweezer type electrodes |
| 2.8 mm Ceramic beads | Omni International | 19-646-3 | DNA extraction |
| 2 mL Tough tubes with caps | Omni International | 19-649 | DNA extraction |
| Aluminosilicate capillaries | Harvard apparatus | 30-0108 | |
| Microloader 20 µL | eppendorf | 5242956.003 | loading tips |
| Petri dishes, 16 mm | Sarsted | 82.1473 | |
| Scalpels | Swan Morton | 0501 | |
| Parafilm | Bemis | laboratory film | |
| Pins | |||
| Plastic spoon | |||
| Spatula | |||
| Sponge | |||
| Styrofoam workbench | |||
| Tweezers |
References
- Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356 (6365), 152-154 (1992).
- Tregoning, J. S., Kinnear, E. Using Plasmids as DNA Vaccines for Infectious Diseases. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
- Evensen, O., Leong, J. A. DNA vaccines against viral diseases of farmed fish. Fish Shellfish Immunology. 35 (6), 1751-1758 (2013).
- Sommerset, I., Lorenzen, E., Lorenzen, N., Bleie, H., Nerland, A. H. A DNA vaccine directed against a rainbow trout rhabdovirus induces early protection against a nodavirus challenge in turbot. Vaccine. 21 (32), 4661-4667 (2003).
- Li, L., Petrovsky, N. Molecular mechanisms for enhanced DNA vaccine immunogenicity. Expert Review of Vaccines. 15 (3), 313-329 (2016).
- Embregts, C. W. E., et al. Intramuscular DNA Vaccination of Juvenile Carp against Spring Viremia of Carp Virus Induces Full Protection and Establishes a Virus-Specific B and T Cell Response. Frontiers in Immunology. 8, 1340 (2017).
- Lorenzen, N., LaPatra, S. E. DNA vaccines for aquacultured fish. Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics). 24 (1), 201-213 (2005).
- Oksanen, K. E., et al. An adult zebrafish model for preclinical tuberculosis vaccine development. Vaccine. 31 (45), 5202-5209 (2013).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), (2004).
- Cho, J. H., Youn, J. W., Sung, Y. C. Cross-priming as a predominant mechanism for inducing CD8(+) T cell responses in gene gun DNA immunization. The Journal of Immunology. 167 (10), 5549-5557 (2001).
- Lewis, K. L., Del Cid, N., Traver, D. Perspectives on antigen presenting cells in zebrafish. Developmental & Comparative Immunology. 46 (1), 63-73 (2014).
- Shao, T., et al. Characterization of surface phenotypic molecules of teleost dendritic cells. Developmental & Comparative Immunology. 49 (1), 38-43 (2015).
- Utke, K., et al. Cell-mediated immune responses in rainbow trout after DNA immunization against the viral hemorrhagic septicemia virus. Developmental & Comparative Immunology. 32 (3), 239-252 (2008).
- Cuesta, A., et al. An active DNA vaccine against infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) with a different mode of action than fish rhabdovirus DNA vaccines. Vaccine. 28 (19), 3291-3300 (2010).
- Castro, R., et al. DNA vaccination against a fish rhabdovirus promotes an early chemokine-related recruitment of B cells to the muscle. Vaccine. 32 (10), (2014).
- Iwanami, N. Zebrafish as a model for understanding the evolution of the vertebrate immune system and human primary immunodeficiency. Experimental Hematology. 42 (8), 697-706 (2014).
- Patterson, H., et al. Adult zebrafish model of bacterial meningitis in Streptococcus agalactiae infection. Developmental & Comparative Immunology. 38 (3), 447-455 (2012).
- Cronan, M. R., Tobin, D. M. Fit for consumption: zebrafish as a model for tuberculosis. Disease Model & Mechanisms. 7 (7), 777-784 (2014).
- Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).
- Parikka, M., et al. Mycobacterium marinum causes a latent infection that can be reactivated by gamma irradiation in adult zebrafish. PLoS Pathogens. 8 (9), e1002944 (2012).
- Rounioja, S., et al. Defense of zebrafish embryos against Streptococcus pneumoniae infection is dependent on the phagocytic activity of leukocytes. Developmental & Comparative Immunology. 36 (2), 342-348 (2012).
- Myllymaki, H., Bauerlein, C. A., Ramet, M. The Zebrafish Breathes New Life into the Study of Tuberculosis. Frontiers in Immunology. 7, 196 (2016).
- Myllymaki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., Ramet, M. Animal models in tuberculosis research - where is the beef? Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).
- Myllymaki, H., et al. Identification of novel antigen candidates for a tuberculosis vaccine in the adult zebrafish (Danio rerio). PLoS One. 12 (7), e0181942 (2017).
- Myllymaki, H., Niskanen, M., Luukinen, H., Parikka, M., Ramet, M. Identification of protective postexposure mycobacterial vaccine antigens using an immunosuppression-based reactivation model in the zebrafish. Disease Model & Mechanisms. 11 (3), (2018).
- Ingolotti, M., Kawalekar, O., Shedlock, D. J., Muthumani, K., Weiner, D. B. DNA vaccines for targeting bacterial infections. Expert Review of Vaccines. 9 (7), 747-763 (2010).
- Kozak, M. Recognition of AUG and alternative initiator codons is augmented by G in position +4 but is not generally affected by the nucleotides in positions +5 and +6. The EMBO Journal. 16 (9), 2482-2492 (1997).
- Matthews, M., Varga, Z. M.
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies? Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
- Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-type response associates with restricted bacterial growth in latent mycobacterial infection of zebrafish. PLoS Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
- Rao, N. M., Rambabu, K. M., Rao, S. H.
- McCaffrey, J., Donnelly, R. F., McCarthy, H. O. Microneedles: an innovative platform for gene delivery. Drug Delivery and Translational Research. 5 (4), 424-437 (2015).
- Lorenzen, E., Lorenzen, N., Einer-Jensen, K., Brudeseth, B., Evensen, O. Time course study of in situ expression of antigens following DNA-vaccination against VHS in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum) fry. Fish and Shellfish Immunology. 19 (1), 27-41 (2005).
- Oksanen, K. Adult Zebrafish Model for Studying DNA-based Vaccination against Mycobacterial Disease. Tampereen yliopisto. , Tampere, Finland. (2011).
