Микродиализом возбуждающих аминокислот во время записи ЭЭГ в свободно перемещающихся крысы

Summary

Здесь мы описываем метод для в vivo микродиализом для анализа аспартата и глутамата релиз в вентральной гиппокампе эпилептические и не эпилептический крыс, в сочетании с записи ЭЭГ. Внеклеточной концентрации и глутамата, аспартата могут быть соотнесены с различных стадиях болезни.

Abstract

Микродиализом представляет собой метод устоявшихся нейробиологии, который коррелирует с изменениями неврологически активных веществ, распространение в мозг интерстициального пространства с поведением или с конкретным результатом патологии (например, изъятия для лечения эпилепсии). При изучении эпилепсии, микродиализом техника часто сочетается с краткосрочной или даже долгосрочные видео электроэнцефалография (ЭЭГ мониторинг оценить спонтанное захват частоты, тяжести, прогрессирование и кластеризации). Комбинированные микродиализом ЭЭГ основана на использовании нескольких методов и инструментов. Здесь мы провели в vivo микродиализом и непрерывной видео ЭЭГ запись монитора глутамата и аспартат отток со временем, на различных этапах естественной истории эпилепсии в мышиной модели. Этот комбинированный подход позволяет сопряжения изменения в версии нейромедиатора с конкретными этапами развития болезни и прогрессии. Амино кислоты концентрации в диализате определяется жидкостной хроматографии. Здесь мы описываем методы и структура, основные меры предосторожности один следует принимать во время микродиализом в vivo -ЭЭГ, особое внимание стереотаксической хирургии, базальную и высокой калия стимуляции во время микродиализом, глубина запись электрода ЭЭГ и высокой производительности жидкостной хроматографии анализ аспартата и глутамата в диализате. Этот подход может быть адаптирована для тестирования различных болезней или наркотиков индуцированной изменения физиологической концентрации аспартата и глутамата в головном мозге. В зависимости от наличия соответствующих аналитических assay он может далее использоваться для тестирования различных растворимых молекул при найме запись ЭЭГ в то же время.

Introduction

Чтобы обеспечить понимание функциональных обесценение глутамат опосредованной возбуждающих и ГАМК ингибирующее синапсах, что приводит к спонтанной изъятий в височной эпилепсии (TLE), мы систематически контролироваться внеклеточной концентрации ГАМК¹ и позже уровнях глутамата и аспартат² микродиализом брюшной гиппокампа крысы в различное время естественной болезни курса, т.е., во время развития и прогрессирования эпилепсии. Мы воспользовались TLE пилокарпин модели крыс, которая имитирует болезни очень точно с точки зрения поведения, электрофизиологических и гистопатологические изменения^3,4 и мы коррелированных диализате концентрацию аминокислот кислоты на его различных этапах: острой фазы после эпилептогенных оскорбление, задержка фазы, время первой спонтанной захват и хронический phass^5,6,7. Обрамление фазы заболевания был включен в долгосрочный видео ЭЭГ-мониторинг и точные ЭЭГ и клиническая характеристика спонтанные судороги. Применение методики микродиализом, связанные с долгосрочной видео ЭЭГ-мониторинг позволил нам предложить механистический гипотезы для TLE невропатологии. Таким образом метод, описанный в этой рукописи позволяет сопряжения нейрохимических изменений в области определенных мозга с развития и прогрессирования эпилепсии в животной модели.

Спаренных устройств, состоящий из глубины электрода, сопоставленные к микродиализом канюлю, часто используются в научных исследований эпилепсии, где изменения нейротрансмиттеров, их метаболитов или энергетических субстратов должна быть соотнесена активности нейронов. В подавляющем большинстве случаев он используется в свободно поведение животных, но он может также проводиться в Аналогичным образом людьми, например, в Фармако стойкие эпилептические больных, перенесших глубина электрода расследование до хирургии⁸. Как запись ЭЭГ, так и диализате коллекция может быть выполнена отдельно (например, имплантировать электроды в одном полушарии и микродиализом зонда в другом полушарии или даже выполнение микродиализом в одной группе животных во время выполнения единственной ЭЭГ в другой группе животных). Однако, сцепка электроды зондов может иметь несколько преимуществ: Это упрощает стереотаксической хирургии, ограничивает повреждения тканей только одно полушарие (с другой стороны, оставляя нетронутыми, как элемент управления для гистологического исследования) и homogenizes результаты как эти получены из того же региона мозга и то же самое животное.

С другой стороны подготовка спаренных микродиализом зонд электрод устройства требует навыков и время если это домашнее. Один может потратить относительно большие суммы денег, если приобретен на рынке. Кроме того, когда микродиализом зонды (пробники, как правило 200-400 мкм в диаметре и длиной 7-12 мм)⁹и ЭЭГ электродов (электродов советы, как правило, 300-500 мкм в диаметре и достаточно долго, чтобы достичь структуры мозга интерес¹⁰) в сочетании, навесные устройства представляет объект относительно тяжелые и громоздкие на одной стороне головы, которая является неприятной для животных и склонны быть потеряно, особенно когда он подключен к диализа насос и система записи ЭЭГ-проволоки. Этот аспект является более актуальным в эпилептические животных, которые трудно справиться и менее адаптивный микродиализом сессий. Надлежащих хирургических методов и соответствующих послеоперационный уход может привести длительное имплантатов, которые вызывают минимальный дискомфорт животных и должно осуществляться для комбинаторной микродиализом ЭЭГ экспериментов^{10,11, 12}.

В деталях были рассмотрены преимущества и ограничения метода микродиализом многие неврологи. Его основное преимущество над другими в vivo перфузии методов (например, быстрый поток двухтактный или корковые Кубок перфузии) является небольшой диаметр зонда, которая охватывает относительно точной области интереса^{13,14, 15}. Во-вторых микродиализом мембрана создает физический барьер между ткани и perfusate; Таким образом высокомолекулярный вес вещества не пересекаются и не мешают анализу^16,17. Кроме того ткань защищен от турбулентного потока perfusate¹⁸. Другим важным преимуществом является возможность изменить поток perfusate для максимальной концентрации аналита в perfusate (т.е., процесс микродиализом может быть также определена математически и может быть изменен приносить высоко концентрации аналита в образце)¹⁹. Наконец метод может использоваться на настаиваться наркотиков или фармакологически активных веществ в ткани интерес и определить их воздействие на сайте вмешательства²⁰. С другой стороны микродиализом имеет ограниченное разрешение время (обычно более 1 мин из-за времени, необходимого для сбора проб) по сравнению с электрохимическими или биологические датчики; это инвазивный метод, который вызывает повреждение тканей; это компрометирует нейрохимических баланс в пространстве вокруг мембраны из-за непрерывного градиент концентрации всех растворимых веществ который входит perfusate вместе с аналита интерес. Наконец метод микродиализом во многом зависит от ограничений аналитических методов, используемых для количественной оценки веществ в perfusate^9,21,22,23 . Высокая производительность жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) после деривации с orthophthaldialdehyde для анализа глутамата и аспартат в биологических образцах был хорошо проверенных^{24,25,26 , 27} и его широкое обсуждение выходит за рамки этой рукописи, однако данные, полученные с помощью этого метода будут описаны подробно.

При выполнении должным образом и без изменений состава perfusate, микродиализом может обеспечить надежную информацию о базальный уровень нейромедиатора релиз. Самая большая часть базальных уровней скорее всего является результатом распространения передатчика от синапсы⁹. Потому, что во многих случаях простой выборки нейромедиатора в загородный синаптического пространства не является достаточным для достижения целей расследования, метод микродиализом также могут быть использованы для стимулирования нейронов или лишить их важных физиологические ионов K⁺ или Ca^{2 +}, для того чтобы вызвать или предотвратить освобождение нейромедиатора.

Высокий K⁺ стимуляция часто используется в нейробиологии стимулировать активность нейронов не только спать животных, но и в начальных и organotypic культур. Экспозиции здоровой центральной нервной системы для решения с высокой концентрацией K⁺ (40-100 мм) вызывает измеряем нейротрансмиттеров²⁸. Эта способность нейронов для предоставления дополнительного выпуска в ответ на высокий K⁺ может быть нарушена в эпилептические животных¹ и в других нейродегенеративных заболеваний^29,30. Аналогично Ca^{2 +} лишения (получено perfusing Ca^{2 +} бесплатные решения) используется для установления кальций зависимых выпуск большинства нейротрансмиттеров, измеряется микродиализом. Считается, что Ca^{2 +} зависимых релиз является нейрональных происхождения, тогда как Ca^{2 +} независимого релиза исходит от глии, но многие исследования подняли споры над смыслью Ca^{2 +}-чувствительных измерения например глутамата или ГАМК⁹: таким образом, если это возможно, рекомендуется для поддержки микродиализом исследования с микропроцессоров исследований, поскольку эти последние имеют более высоким пространственным разрешением и электродов позволяет получить ближе к синапсы³¹.

Что касается микродиализом исследований в эпилептические животных важно подчеркнуть, что данные, полученные от большинства из них полагаются на видео или видео ЭЭГ мониторинг судорог, то есть, переходных вхождения признаки или симптомы из-за ненормального чрезмерное или синхронной активность нейронов в мозге³². Есть некоторые особенности электрографические изъятий в пилокарпин лечить животных, которые следует учитывать при подготовке эксперимента. Спонтанные судороги следуют депрессии активности с частыми ЭЭГ межприступная шипы³ и происходят в кластеры^33,34. Шам эксплуатируемых животных не эпилептическими припадками, могут демонстрировать захват как деятельность³⁵ и поэтому параметры для записи ЭЭГ оценки должны быть стандартные³⁶ , и, если возможно, должны быть четко определены сроки проведения сессий микродиализом. Наконец мы настоятельно рекомендуем следующие принципы и методологических стандартов для видео ЭЭГ-мониторинг управления взрослых грызунов изложенные экспертами Международная лига против эпилепсии и американского общества эпилепсии в своих последних докладах^{37 ,38}.

Здесь мы описываем микродиализом глутамата и аспартат параллельно с долгосрочной записи видео ЭЭГ в эпилептические животных и их анализ в диализате ВЭЖХ. Мы будем делать упор критические шаги протокола, один должен заботиться о для наилучшего результата.

Protocol

Все экспериментальные процедуры были одобрены Университетом Феррара институциональный уход животных и использование Комитета и итальянским министерством здравоохранения (авторизация: д.м. 246/2012-B) в соответствии с руководящими принципами, изложенными в европейских сообществ Директи?…

Representative Results

Зонд восстановления Среднее восстановление (т.е., среднее аминокислоты содержание в perfusate как процент содержания в равный объем раствора во флаконе) было 15.49 ± 0,42% при скорости потока 2 мкл/мин и 6.32 ± 0,64 3 мкл/мин для глутамата и 14.89 ± 0,36% …

Discussion

В этой работе мы покажем, как непрерывной записи видео ЭЭГ, в сочетании с микродиализом может быть выполнена в экспериментальной модели TLE. Для правильно диагностировать различные этапы прогрессирования заболевания у животных, используются методы записи видео-ЭЭГ и микродиализом техн…

Materials

3-channel two-twisted electrode	Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA	MS333/3-B/SPC	Material
guide cannula	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	MAB 4.15.IC	Material
Resin KK2 Plastik	Elettra Sport, Lecco, Italy	KK2	Material
Super Attack gel Loctite	Henkel Italia Srl, Milano, Italy	2047420_71941	Material
Imalgene-Ketamine	Merial, Toulouse, France	221300288 (AIC)	Solution
Xylazine	Sigma, Milano, Italy	X1251	Material
Isoflurane-Vet	Merial, Toulouse, France	103120022 (AIC)	Solution
Altadol 50 mg/ ml – tramadol	Formevet, Milano, Italy	103703017 (AIC)	Solution
Gentalyn 0.1% crm – gentamycine	MSD Italia, Roma, Italy	20891077 (AIC)	Material
simplex rapid dental cement	Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom	ACR811	Material
GlasIonomer CX-Plus Cement	Shofu, Kyoto, Japan	PN1167	Material
probe clip holder	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	p/n 100 5001	Equipment
Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive	TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA	TS1050044FP	Material
Valium 10 mg/2 ml – diazepam	Roche, Monza, Italy	019995063 (AIC)	Material
1 mL syringe with 25G needle	Vetrotecnica, Padova, Italy	11.3500.05	Material
rat flexible feeding needle 17G	Agn Tho's, Lindigö Sweden	7206	Material
Grass Technology apparatus	Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA	M665G08	Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
modular data acquisition and analysis system MP150	Biopac, Goleta, California, USA	MP150WSW	Equipment
digital video surveillance system	AverMedia Technologies, Fremont, California, USA	V4.7.0041FD	Equipment
microdialysis probe	Agn Tho's, Lindigö Sweden	MAB 4.15.1.Cu	Material
microdialysis probe	Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA	S-8010	Material
block heater	Grant Instruments, Cambridge, England	QBD2	Equipment
stirrer	Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy	711	Equipment
infusion pump	Univentor, Zejtun, Malta	864	Equipment
fine bore polythene tubing	Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA	800/100/100/100	Material
blue tubing adapters	Agn Tho's, Lindigö Sweden	1002	Material
red tubing adapters	Agn Tho's, Lindigö Sweden	1003	Material
2.5 mL syringe with 22G needle	Chemil, Padova, Italy	S02G22	Material
vial cap	Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic	VCA-1004TB-100	Material
septum	Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA	National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum	Material
glass insert with bottom spring	Supelco, Sigma, Milano, Italy	27400-U	Material
autosampler vial	National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy	C4013-2	Material
Smartline manager 5000 system controller and degasser unit	Knauer, Berlin, Germany	V7602	Equipment
Smartline 1000 quaternary gradient pump	Knauer, Berlin, Germany	V7603	Equipment
spectrofluorometric detector	Shimadzu, Kyoto, Japan	RF-551	Equipment
chromatogrphic column	Knauer, Berlin, Germany	25EK181EBJ	Material
chromatogrphic pre-column	Knauer, Berlin, Germany	P5DK181EBJ	Material
mobile phase solution A	0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0		Solution
mobile phase solution B	40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5		Solution
Ringer solution	composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA		Solution
modified Ringer solution	composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA		Solution
saline	0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0		Solution
sucrose solution	10% sucrose in distilled water		Solution