रीयल-टाइम इमेजिंग और फंगल ठहराव के विकास की एक दो चरण के पुनर्संचारित प्रवाह प्रणाली का उपयोग कर
Summary
हम विधानसभा, संचालन का वर्णन है, और प्रवाह के तहत, जबकि वास्तविक समय में छवि कवक फिल्म गठन के लिए डिजाइन एक तंत्र की सफाई । हम भी प्रदान करते है और मात्रात्मक एल्गोरिदम पर चर्चा का अधिग्रहण छवियों पर इस्तेमाल किया जाएगा ।
Abstract
oropharyngeal कैंडिडिआसिस में, जीनस Candida के सदस्यों और मौखिक श्लैष्मिक सतह पर बढ़ने का पालन करना चाहिए, जबकि लार प्रवाह के प्रभाव के तहत । जबकि प्रवाह के तहत विकास के लिए मॉडल विकसित किया गया है, इन प्रणालियों के कई महंगे हैं, या इमेजिंग की अनुमति नहीं है जबकि कोशिकाओं के प्रवाह के तहत कर रहे हैं । हम एक उपंयास तंत्र है कि हमें छवि के विकास और प्रवाह के तहत Candida albicans कोशिकाओं के विकसित करने के लिए और वास्तविक समय में अनुमति देता है विकास किया है । यहां, हम विधानसभा और इस प्रवाह तंत्र के उपयोग के लिए प्रोटोकॉल विस्तार, साथ ही साथ डेटा उत्पंन कर रहे है कि ठहराव । हम दरों है कि कोशिकाओं को देते है और स्लाइड से अलग है, साथ ही समय के साथ स्लाइड पर बायोमास का एक उपाय निर्धारित करने में सक्षम हैं । इस प्रणाली दोनों किफायती और बहुमुखी, सस्ती benchtop सूक्ष्मदर्शी सहित प्रकाश सूक्ष्मदर्शी के कई प्रकार के साथ काम कर रहा है, और विस्तारित इमेजिंग समय के अंय प्रवाह प्रणालियों की तुलना में सक्षम है । कुल मिलाकर, इस प्रवाह के तहत कवक प्रजातियों के उच्च फिल्म विकास पर अत्यधिक विस्तृत वास्तविक समय की जानकारी प्रदान कर सकते है कि एक कम प्रवाह प्रणाली है ।
Introduction
Candida albicans (सी. albicans) मनुष्यों की एक अवसरवादी कवक रोगज़नक़ है कि मौखिक श्लैष्मिक सतहों सहित कई प्रकार के ऊतकों को संक्रमित कर सकते हैं, oropharyngeal कैंडिडिआसिस के कारण और प्रभावित व्यक्तियों के लिए जीवन की एक कम गुणवत्ता में जिसके परिणामस्वरूप1। फिल्म गठन सी albicansके रोगजनन के लिए एक महत्वपूर्ण विशेषता है, और कई अध्ययनों के गठन और c. albicans के समारोह पर किया गया है2,3,4, 5, जिनमें से कई स्थैतिक का उपयोग कर आयोजित किया गया है (कोई प्रवाह) इन विट्रो मॉडल । हालांकि, C. albicans पालन और मौखिक गुहा में लार प्रवाह की उपस्थिति में विकसित करना चाहिए । कई प्रवाह प्रणालियों के लिए लाइव सेल इमेजिंग6,7,8,9,10के लिए अनुमति विकसित किया गया है । इन विभिंन प्रवाह प्रणालियों विभिंन प्रयोजनों के लिए डिजाइन किया गया है, और इसलिए प्रत्येक प्रणाली अलग शक्तियों और कमजोरियों है । हमने पाया है कि albicans के लिए उपयुक्त प्रवाह प्रणालियों के कई महंगे थे, आवश्यक परिसर गढ़े भागों, या प्रवाह के दौरान छवि नहीं किया जा सकता है और इमेजिंग करने से पहले बंद कर दिया था । इसलिए, हम प्रवाह11के अंतर्गत C. albicans फिल्म गठन का अध्ययन करने के लिए एक उपंयास प्रवाह तंत्र विकसित की है । हमारे प्रवाह तंत्र के डिजाइन के दौरान, हम इन प्रमुख बातों का पालन किया । सबसे पहले, हम फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के उपयोग की आवश्यकता के बिना (हमें उत्परिवर्ती उपभेदों और unmodified नैदानिक आसानी से अलग से अध्ययन करने की अनुमति) के लिए वास्तविक समय में फिल्म के विकास और विकास के कई पहलुओं को मात्रा में सक्षम होना चाहता था । दूसरा, हम सभी भागों चाहता था कि कोई संशोधनों को थोड़ा के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हो (यानी, कोई कस्टम निर्माण), दूसरों को और अधिक आसानी से हमारी प्रणाली विश्राम की अनुमति है, और आसान मरंमत के लिए अनुमति दी । तीसरा, हम भी काफी उच्च प्रवाह दर पर विस्तारित इमेजिंग बार के लिए अनुमति देना चाहता था । अंत में, हम चाहते थे, प्रवाह के तहत सब्सट्रेट करने के लिए संलग्न कोशिकाओं की अवधि के बाद, नई कोशिकाओं को शुरू करने के बिना एक विस्तारित समय पर फिल्म विकास की निगरानी करने में सक्षम हो.
इन बातों का नेतृत्व हमें दो विकसित करने के लिए-कुप्पी पुनर्संचारी प्रवाह प्रणाली 1 चित्रामें सचित्र । दो कुप्पी हम दो चरणों में प्रयोग विभाजित करने के लिए अनुमति देते हैं, एक लगाव चरण है कि सेल से ड्रॉ-वरीयता प्राप्त लगाव कुप्पी, और एक विकास चरण है कि सेल मुक्त मीडिया का उपयोग करता है के लिए नई कोशिकाओं के अलावा बिना फिल्म विकास जारी है । इस प्रणाली को माइक्रोस्कोप के लिए एक मशीन चैंबर के साथ काम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, स्लाइड के साथ और यह पूर्ववर्ती टयूबिंग (2 से 5, चित्रा 1) मशीन के अंदर रखा जा रहा है, और अंय सभी घटकों के बाहर एक बड़े माध्यमिक कंटेनर में रखा माइक्रोस्कोप. इसके अतिरिक्त, एक संलग्न तापमान जांच के साथ एक चूल्हा सरगर्मी ३७ डिग्री सेल्सियस पर लगाव कुप्पी में कवक कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है । के रूप में यह पुनर्संचारी है, इस प्रणाली के प्रवाह के दौरान सतत इमेजिंग में सक्षम है (३६ से अधिक हो सकता है एच शर्तों के आधार पर), और सबसे मानक सूक्ष्मदर्शी, ईमानदार या उल्टे benchtop सूक्ष्मदर्शी सहित पर इस्तेमाल किया जा सकता है । यहां, हम विधानसभा, संचालन पर चर्चा, और प्रवाह तंत्र की सफाई, साथ ही साथ कुछ बुनियादी ImageJ मात्रात्मक एल्गोरिदम प्रदान करने के लिए एक प्रयोग के बाद वीडियो का विश्लेषण ।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रवाह प्रणाली का उपयोग कर के रूप में ऊपर उल्लिखित मात्रात्मक समय कवक के फिल्म विकास और विकास के चूक वीडियो की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है । प्रयोगों के बीच तुलना के लिए अनुमति देने के लिए यह महत्वपूर्ण…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों के प्रवाह तंत्र के डिजाइन में मूल्यवान इनपुट प्रदान करने के लिए डॉ वेड Sigurdson स्वीकार करना चाहते हैं ।
Materials
| Pump | Cole Parmer | 07522-20 | 6 |
| Pump head | Cole Parmer | 77200-60 | 6 |
| Tubing | Cole Parmer | 96410-14 | N/A |
| Bubble trap adapter | Cole Parmer | 30704-84 | 3 |
| Bubble trap vacuum adapter for 1/4” ID vacuum line | Cole Parmer | 31500-55 | 3 |
| In-line filter adapter (4 needed) | Cole Parmer | 31209-40 | 8,9 |
| Orange-side Y | Cole Parmer | 31209-55 | 7 |
| Green-side Y | ibidi | 10827 | 2 |
| * Slides | ibidi | 80196 | 4 |
| * Slide luers | ibidi | 10802 | 4 |
| Vacuum assisted Bubble trap | Elveflow/Darwin microfluidics | KBTLarge – Microfluidic Bubble Trap Kit | 3 |
| Media flasks | Corning | 4980-500 | 1 |
| 0.2 µm air filter | Corning | 431229 | 1 |
| Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed) | Corning | 1395-100 | 5,10 |
| Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed) | Wheaton | 1129750 | 5,10 |
| Screwcap tubing connector | Wheaton | 1129814 | 5,10 |
| Tubing connector beveled washer | Danco | 88579 | 5,10 |
| Tubing connector flat washer | Danco | 88569 | 5,10 |
| Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed) | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 15100002-100 | 7,8,9 |
| Clamp tool | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 14100386 | N/A |
| 20 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1331 | 8 |
| 10 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1333 | 9 |
| 2 micron inlet media filter | Supelco/Sigma-Aldrich | 58267 | 10 |
| * 0.22 µm media filter | Millipore | SVGV010RS | 11 |
| * 0.22 µm media filter “adapter” | BD Biosciences | 329654 | 11 |
| Rubber stopper | Fisher Scientific | 14-131E | 1 |
| Hotplate stirrer with external probe port | ThermoFisher Scientific | 88880006 | N/A |
| Temperature probe | ThermoFisher Scientific | 88880147 | N/A |
References
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