Brug af elektron paramagnetisk resonans i biologiske prøver ved omgivende temperatur og 77 K
Summary
Elektron paramagnetisk resonans (EPR) spektroskopi er en entydig metode til at måle frie radikaler. Brugen af selektive spin sonder giver mulighed for påvisning af frie radikaler i forskellige cellulære rum. Vi præsenterer en praktisk, effektiv metode til at indsamle biologiske prøver, som letter behandling, lagring og overførsel af prøver for EPR målinger.
Abstract
Præcis og specifik påvisning af reaktive ilt arter (ROS) i forskellige cellulære og væv rum er afgørende for studiet af redox-regulerede signalering i biologiske indstillinger. Elektron paramagnetisk resonans-spektroskopi (EPR) er den eneste direkte metode til at vurdere frie radikaler utvetydigt. Dens fordel er at det registrerer fysiologiske niveauer af specifikke arter med en høj specificitet, men det kræver specialiseret teknologi, omhyggelig prøveforberedelsen og passende kontrol for at sikre præcis fortolkning af data. Cyklisk hydroxylamin spin sonder reagerer selektivt med superoxid eller andre radikale til at generere en nitroxide signal, at kan kvantificeres ved EPR spektroskopi. Celle-gennemtrængelige spin sonder og spin sonder designet til at ophobe sig hurtigt i mitokondrierne mulighed for bestemmelse af superoxid koncentration i forskellige cellulære rum.
I dyrkede celler, brug af celle permeable 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) langs med og uden celle-vandtætte Superoxid dismutase (SOD) forbehandling eller anvendelse af celle-gennemtrængelige PIND-SOD, giver mulighed for at differentiering af ekstracellulære fra cytosole superoxid. Den mitokondrielle 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] piperidinium dichloride (mito-TEMPO-H) giver mulighed for måling af mitokondrie ROS (overvejende superoxid).
Spin sonder og EPR spektroskopi kan også anvendes til i vivo modeller. Superoxid kan påvises i ekstracellulære væske som blod og alveolær væske samt væv såsom lungevæv. Flere metoder præsenteres for at behandle og opbevare væv for EPR målinger og levere intravenøs 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) spin sonde in vivo. Mens målinger kan udføres ved stuetemperatur, kan prøver fra in vitro- og i vivo modeller også opbevares ved-80 ° C og analyseret af EPR på 77 K. Prøverne kan gemmes i specialiserede slanger stabile ved-80 ° C og køre på 77 K til at aktivere en praktisk, effektiv, og reproducerbar metode, der letter lagring og overførsel prøver.
Introduction
Mens oxidativ stress og reaktive ilt arter er vigtige for studiet af forskellige sygdomme på tværs af alle organsystemer, er påvisning af reaktive ilt arter (ROS) udfordrende på grund af en kort halveringstid og høj reaktivitet. En elektron paramagnetisk resonans (EPR) teknik er den mest utvetydige metode til påvisning af frie radikaler. Spin sonder har fordele frem for de mere almindeligt brugte fluorescerende sonder. Selvom fluorescerende sonder er relativt billig og nem at bruge og giver hurtige, følsomme påvisning af ROS, har de alvorlige begrænsninger på grund af kunstig signaler, manglende evne til at beregne ROS koncentrationer, og en generel mangel på specificitet1 .
For at lette anvendelsen af EPR til biologiske undersøgelser, en bred vifte af spin sonder har været syntetiseret, der kan måle en række biologisk relevante frie radikaler arter samt pO2, pH og redox hedder2,3, 4,5,6,7. Spin traps har også udviklet til at fange kortlivede radikaler og form long-levende adukter, hvilket muliggør detektion ved EPR8. Begge klasser (spin sonder og spin traps) har fordele og begrænsninger. Almindeligt anvendte klasser i spin sonder er cyklisk hydroxylamines, som er EPR-tavs og reagere med kortvarig radikaler til at danne en stabil nitroxide. Cyklisk hydroxylamines reagerer med superoxid 100 gange hurtigere end spin traps, gør det muligt for dem at konkurrere med cellulære antioxidanter, men de mangler specificitet og har brug for passende kontrol og hæmmere at identificere radikale arter eller kilde ansvarlig for nitroxide signal. Mens spin fælder udstille specificitet, med særskilte spektrale mønstre afhængig af de fangne arter, de har langsom kinetik for superoxid spin diffusering og er udsat for bionedbrydning af radikale adukter. Ansøgninger om spin fældefangst har været veldokumenteret i biomedicinsk forskning9,10,11,12,13.
Målet med dette projekt er at demonstrere praktisk EPR metoder til at designe eksperimenter og prøver at opdage superoxid ved hjælp af spin sonder i forskellige cellulære rum in vitro og i forskellige væv rum i vivo. Flere manuskripter er offentliggjort protokollerne relevante for disse mål, ved hjælp af celle-gennemtrængelige, celle-vandtætte og mitokondriel målrettede spin sonder til forskellige cellulære rum i vitro og proces målvæv for analyse i musemodeller 14 , 15. vi bygge videre på dette organ af litteratur ved at validere en tilgang til at måle superoxid ved hjælp af en 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) spin sonde i forskellige cellulære rum i vitro for at sikre nøjagtig målinger, fremhæve eventuelle tekniske problemer, som kan give en skævhed resultater. Vi leverer også metoder til at udføre EPR målinger i blod, bronchoalveolar lavage væske og lungevæv ved hjælp af CMH spin sonde. Disse undersøgelser sammenligne forskellige metoder til at behandle væv samt præsentere en metode til at injicere en anden spin sonde, CPH, ind i musene før høst væv. Endelig vil udvikle vi en praktisk metode til at gemme prøver i polytetrafluorethylen (PTFE) slanger at give mulighed for lagring og overførsel af prøver før EPR målinger på 77 K.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vurdering af frie radikaler produktion i biologiske indstillinger er vigtig i forståelsen redox reguleret signalering i sundhed og sygdom, men et mål for disse arter er meget udfordrende på grund af den korte half-life af frie radikaler arter og tekniske begrænsninger med almindeligt anvendte metoder. EPR er en værdifuld og kraftfulde værktøj i redox biologi, da det er den kun entydige metode til påvisning af frie radikaler. I dette projekt, vi vise praktiske EPR metoder til at designe eksperimenter og prøver at…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af University of Colorado School of Medicine Deans strategiske forskningsinfrastruktur award, R01 HL086680-09 og 1R35HL139726-01, at E.N.G. og UCD CFReT fellowship award, (han). Forfatterne takke Dr. Sandra Eaton og Dr. Gareth Eaton (universitetet i Denver), Dr. Gerald Rosen og Dr. Joseph P. Kao (University of Maryland), og Dr. Sujatha Venkataraman (University of Colorado Denver) til nyttige diskussioner og Joanne Maltzahn, Ashley Trumpie og Ivy McDermott (University of Colorado Denver) for teknisk support.
Materials
| DMEM | LifeTech | 10566-016 | cell culture media |
| Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) | Sigma Aldrich | D6518-5G | |
| sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| potassium phosphate dibasic (HK2PO4 ) | Fisher Scientific | BP363-500 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| potassium phosphate monobasic (KH2PO4 ) | Sigma Aldrich | P-5379 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| Krebs-Henseleit buffer (KHB) | (Alfa Aesar, Hill) | J67820 | |
| Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD) | Sigma Aldrich | S7571-30KU | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P1585-1MG | Dissolve in DMSO |
| Antimycin A (AA) | Sigma Aldrich | A8674-25MG | Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots) |
| 1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-117-M050 | |
| 1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-078-M250 | |
| 1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H) | Enzo Life Sciences | ALX-430-171-M005 | |
| 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H) | Enzo Life Sciences | ALX-430-131-M250 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| Diphenyliodonium chloride | Sigma Aldrich | 43088 | |
| Deferoxamin mesylate salt | Sigma Aldrich | D9533-1G | |
| Critoseal | Leica | 39215003 | |
| BRAND disposable BLAUBRAND micropipettes, intraMark | Sigma Aldrich | 708733 | Capillaries |
| PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING 3/16” OD x 1/8” ID |
NORELL | 1598774A | Teflon tubing |
| SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR | NORELL | 94987 | |
| EMXnano Bench-Top EPR spectrometer | Bruker BioSpin GmbH | E7004002 | |
| EMX NANO TISSUE CELL | Bruker BioSpin GmbH | E7004542 |
References
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
- Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magnetic Resonance in Medicine. 67 (6), 1827-1836 (2012).
- Elajaili, H. B., et al. Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals. Magnetic Resonance in Chemistry. 53 (4), 280-284 (2015).
- Elajaili, H., et al. Imaging disulfide dinitroxides at 250 MHz to monitor thiol redox status. Journal of Magnetic Resonance. 260, 77-82 (2015).
- Halpern, H. J., et al. Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic-Resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 13047-13051 (1994).
- Epel, B., et al. Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc. Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).
- Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy. 생화학. 54 (47), 6973-6982 (2015).
- Abbas, K., et al. Medium-throughput ESR detection of superoxide production in undetached adherent cells using cyclic nitrone spin traps. Free Radical Research. 49 (9), 1122-1128 (2015).
- Dikalov, S. I., et al. Distinct roles of Nox1 and Nox4 in basal and angiotensin II-stimulated superoxide and hydrogen peroxide production. Free Radical Biology and Medicine. 45 (9), 1340-1351 (2008).
- Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor’ev, I. A. EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines. Free Radical Research. 45 (4), 417-430 (2011).
- Dikalova, A. E., et al. Therapeutic Targeting of Mitochondrial Superoxide in Hypertension. Circulation Research. 107 (1), 106-116 (2010).
- Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. Electron Paramagnetic Resonance Measurements of Reactive Oxygen Species by Cyclic Hydroxylamine Spin Probes. Antioxidants & Redox Signaling. , (2017).
- Sharma, S., et al. L-Carnitine preserves endothelial function in a lamb model of increased pulmonary blood flow. Pediatric Research. 74 (1), 39-47 (2013).
- Berg, K., Ericsson, M., Lindgren, M., Gustafsson, H. A High Precision Method for Quantitative Measurements of Reactive Oxygen Species in Frozen Biopsies. PloS One. 9 (3), (2014).
- Kozlov, A. V., et al. EPR analysis reveals three tissues responding to endotoxin by increased formation of reactive oxygen and nitrogen species. Free Radical Biology and Medicine. 34 (12), 1555-1562 (2003).
- Van Rheen, Z., et al. Lung Extracellular Superoxide Dismutase Overexpression Lessens Bleomycin-Induced Pulmonary Hypertension and Vascular Remodeling. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 500-508 (2011).
- Mouradian, G. C., et al. Superoxide Dismutase 3 R213G Single-Nucleotide Polymorphism Blocks Murine Bleomycin-Induced Fibrosis and Promotes Resolution of Inflammation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (3), 362-371 (2017).
- Dikalov, S. I., Li, W., Mehranpour, P., Wang, S. S., Zafari, A. M. Production of extracellular superoxide by human lymphoblast cell lines: comparison of electron spin resonance techniques and cytochrome C reduction assay. Biochem Pharmacol. 73 (7), 972-980 (2007).
- Kozuleva, M., et al. Quantification of superoxide radical production in thylakoid membrane using cyclic hydroxylamines. Free Radical Biology and Medicine. 89, 1014-1023 (2015).
- Chen, K., Swartz, H. M. Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells. Biochimica Et Biophysica Acta. 970 (3), 270-277 (1988).
