Определение события гомологичная рекомбинация в мышиных эмбриональных стволовых клеток с использованием южный Blotting и цепной реакции полимеразы
Summary
Здесь мы представляем подробный протокол для выявления гомологичная рекомбинация события, которые произошли в мышиных эмбриональных стволовых клеток с использованием Южный blotting или ПЦР. Этот метод является примером поколения nonmuscle миозин II генетических замена мыши модели с использованием традиционных эмбриональных стволовых клеток-технологию на основе гомологичных рекомбинации опосредованной таргетинга.
Abstract
Относительно вопросов пробить эффектов и сложности вставке длинный фрагмент ДНК в применение конструктора nucleases для редактирования, эмбриональных стволовых генома технологии гена таргетинг на основе клеток (ES) не имеют таких недостатков и широко используется для изменения генома животных/мыши от большого удаления/вставки до единичных нуклеотидных замен. Особенно выявления сравнительно мало гомологичная рекомбинация (HR) события, необходимые для получения желаемого ES клонов является ключевым шагом, который требует точных и надежных методов. Южный blotting или обычных PCR часто используются для этой цели. Здесь мы описываем подробные процедуры использования этих двух методов для идентификации HR события, которые произошли в мыши ES клеток, в которых эндогенного ген Myh9 предназначен для быть нарушена и заменены cDNAs кодирования другие nonmuscle тяжелой цепи миозина IIs (IIs НЦПЗ). Вся процедура Южный blotting включает строительство ориентации vector(s), электропорация, выбор наркотиков, расширения и хранения клеток ES/клоны, подготовка, пищеварение и промокательной геномной ДНК (геномная ДНК), гибридизации и Мойка кислородных и заключительный шаг авторадиографии на рентгеновских пленок. ПЦР могут быть выполнены непосредственно с подготовленной и разбавленных геномная ДНК. Для получения идеальных результатов, следует тщательно планировать зонды и энзима ограничения (пере) вырубки для Южный blotting и грунты для ПЦР. Хотя выполнение Южный blotting является длительным и трудоемким и ПЦР результаты ложных срабатываний, правильной идентификации, Южный blotting и быстрого скрининга методом ПЦР позволяют единственным или комбинированного применения этих методов, описанных в настоящем документе, широко используется и консультации, большинство лабораторий в идентификации генотипов ES клеток и генетически изменены животных.
Introduction
Технология гена, ориентирование по HR в мышиных клетки ES обеспечивает мощный инструмент для рассечения сотовой последствия конкретных генетических мутаций1,2. Важность и значение этой технологии отражаются в его признании 2007 Нобелевской премии по физиологии и медицине3,4; Тем временем он представляет собой наступление современной эры гена инженерных5. Джин, ориентация через HR могут быть использованы для инженер практически любые изменения от точечные мутации до больших хромосомных перестроек в геноме мыши ES клеток6,7. Хорошо известно, что, перед появлением так называемых генома инструменты редактирования, поколения мыши Нокаут гена требуется применение технологии гена ориентация в ES клеток8,9,10. В течение последних двух десятилетий более чем 5000 целевых генов мышей были произведены этот подход для моделирования заболеваний человека или изучении генной функции11. Геном общесистемной нокаут усилий была создана для распространения ген ориентации векторов, целенаправленных клоны клеток ES и живой мышей, чтобы научное сообщество2,12,13,14 , 15. несомненно, ES клеток HR-опосредованной ген ориентация технологии значительно расширенный нашего понимания функций генов играл в физиологических и патологических контексте.
Потому что HR является сравнительно редким событием в млекопитающих клетки16,17, является важным и следующий шаг после гена ориентации в мышиных ES клеток заключается в анализе многочисленных колоний ES для выявления несколько клонов с результатом мутации HR с ориентации вектора18. Золотые методы для выявления HR события включают Южный blotting и ПЦР19,20. Преимущества подходов включают что Южный blotting может определить правильно целевых ES клоны и позволяет исследователям анализировать структуру гена целевой события, например проверку одной копии вставки конструкции, тогда как Стратегия на основе ПЦР позволяет более быстрого скрининга для HR события21,22. Хотя эти методы имеют свои недостатки, такие как что они много времени и может иметь ложных срабатываний, комбинационный использование их является широко приняты и применяются организациями большинство лабораторий в определении события HR, особенно в ES клеток, для генерации генетически измененными животных.
Три изоформ nonmuscle миозин II (Нм II) млекопитающих, каждая из которых состоит из двух идентичных NMHC IIs, которые кодируются с трех различных генов (именованные Myh9, Myh10 и Myh14) и две пары легких цепей, называются Нм II-A, II-B и II-C23. Предыдущие исследования показали, что по крайней мере изоформ Нм II-A и II-B важны для развития мыши, потому что в vivo абляции этих изоформ приводит к эмбриональной летальность24,25,26. Чтобы обойти эту проблему и получить новые идеи в изоформы специфичные функции Нм II-A и II-B на более поздних этапах развития мыши, генетических замена была принята стратегия, с использованием ES клеток HR-опосредованной ген ориентация технологии для генерировать серию мыши модели27. В ходе определения желаемого ES клоны, Южный blotting и ПЦР методы были использованы, и они оказались эффективной и надежной в27,28.
Этот документ намеревается представить подробное описание Южный blotting и ПЦР, включая разработку ориентированных на vector(s), кислородных и грунтовки и выполнения экспериментов, а также анализ полученных результатов свидетельствует выявление событий HR вхождение в клетки ES для создания генетических замена Нм II мыши модели и репрезентативных данных. Протоколы этих двух методов, представленные здесь также могут быть приняты для идентификации генотипов генетически модифицированные клетки или животных.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящее время дизайнер nucleases для изменения генома до сих пор не может заменить ES клеток ген ориентация технологии из-за своих проблем-целевого воздействия, и трудности в вставке длинный ДНК фрагмента30,31. Как Золотой методы для выявления HR события, кот?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа получила поддержку Генеральной программы национального фонда естественных наук Китая (гранты № 31571432), человека провинциальных фонд Китая по естественным наукам (Грант № 2015JC3097) и исследовательский фонд образования бюро Хунань Провинция, Китай (Грант № 15 K 054).
Materials
| BAC CLONE | BACPAC Resources Center (BPRC) | bMQ-330E21 | |
| QIAGEN Large-Construct Kit | QIAGEN | 12462 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit | QIAGEN | 12963 | |
| PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase | Agilent | 600382 | |
| T-easy vector | Promega | A1360 | |
| Nuclei Lysis Solution | Promega | A7941 | |
| Protein Precipitation Solution | Promega | A7951 | |
| DNA Denaturing Solution | VWR | 351-013-131 | |
| DNA Neutralizing Solution | VWR | 351-014-131 | |
| Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP) | VWR | 27-9240-01 | |
| UltraPure SSC, 20X | Thermo Fisher | 15557036 | |
| UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | 15593031 | |
| G418 | Thermo Fisher | 10131035 | |
| Salmon Sperm DNA Solution | Thermo Fisher | 15632011 | |
| Platinu Taq DNA Polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304029 | |
| Not I | Thermo Scientific | ER0592 | |
| Dra I | Thermo Scientific | ER0221 | |
| EcoR I | Thermo Scientific | ER0271 | |
| Ganciclovir | Sigma | G2536 | |
| Whatman TurboBlotter Transfer System, Large Kits | Fisher Scientific | 09-301-188 | |
| [α32P]dCTP | PerkinElmer | NEG013H100UC | |
| ProbeQuan G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | |
| Hybrisol I Hybridization Solution | Millipore | S4040 | |
| Kodak X-Ray Film | Z&Z Medical | 844 5702 |
References
- Gao, G., McMahon, C., Chen, J., Rong, Y. A powerful method combining homologous recombination and site-specific recombination for targeted mutagenesis in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 13999-14004 (2008).
- Skarnes, W., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337-342 (2011).
- Vogel, G. Nobel Prizes. A knockout award in medicine. Science. 318 (5848), 178-179 (2007).
- Salsman, J., Dellaire, G. Precision genome editing in the CRISPR era. Biochemistry. Cell Biology. 95 (2), 187-201 (2017).
- Capecchi, M. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nature Reviews Genetics. 6 (6), 507-512 (2005).
- Van, d. W. L., Adams, D. J., Bradley, A. Tools for targeted manipulation of the mouse genome. Physiological Genomics. 11 (3), 133-164 (2002).
- Glaser, S., Anastassiadis, K., Stewart, A. F. Current issues in mouse genome engineering. Nature Genetics. 37 (11), 1187 (2005).
- Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309 (5965), 255-256 (1984).
- Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature. 323 (6087), 445-448 (1986).
- Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51 (3), 503-512 (1987).
- Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337 (2011).
- Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), 9-13 (2007).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).
- Pettitt, S. J., et al. Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources. Nature Methods. 6 (7), 493-495 (2009).
- Gertsenstein, M., et al. Efficient Generation of Germ Line Transmitting Chimeras from C57BL/6N ES Cells by Aggregation with Outbred Host Embryos. PLoS One. 5 (6), 11260 (2012).
- Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal |[beta]|-globin locus by homologous recombination. Nature. 317 (6034), 230-234 (1985).
- Deng, C., Capecchi, M. R. Reexamination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeting vector and the target locus. Molecular & Cellular Biology. 12 (8), 3365 (1992).
- Lay, J. M., Friishansen, L., Gillespie, P. J., Samuelson, L. C. Rapid confirmation of gene targeting in embryonic stem cells using two long-range PCR techniques. Transgenic Research. 7 (2), 135-140 (1998).
- Langerak, P., Nygren, A. O. H., Schouten, J. P., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
- Gómezrodríguez, J., et al. Advantages of q-PCR as a method of screening for gene targeting in mammalian cells using conventional and whole BAC-based constructs. Nucleic Acids Research. 36 (18), 117 (2008).
- Kim, H. S., Smithies, O. Recombinant fragment assay for gene targeting based on the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Research. 16 (18), 8887-8903 (1988).
- Joyner, A. L., Skarnes, W. C., Rossant, J. Production of a mutation in mouse En-2 gene by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 338 (6211), 153-156 (1989).
- Ma, X., Adelstein, R. S. The role of vertebrate nonmuscle Myosin II in development and human disease. Bioarchitecture. 4 (3), 88-102 (2014).
- Malonek, D. Relationships between the dynamics of cortical blood flow, oxygenation, and volume changes following sensory stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, (1997).
- Takeda, K., Kishi, H., Ma, X., Yu, Z. X., Adelstein, R. S. Ablation and mutation of nonmuscle myosin heavy chain II-B results in a defect in cardiac myocyte cytokinesis. Circulation Research. 93 (4), 330-337 (2003).
- Conti, M. A., Evenram, S., Liu, C., Yamada, K. M., Adelstein, R. S. Defects in cell adhesion and the visceral endoderm following ablation of nonmuscle myosin heavy chain II-A in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41263-41266 (2004).
- Wang, A., et al. Nonmuscle myosin II isoform and domain specificity during early mouse development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (33), 14645-14650 (2010).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238 (2012).
- Liu, T., et al. Identification and characterization of MYH9 locus for high efficient gene knock-in and stable expression in mouse embryonic stem cells. PLoS One. 13 (2), 0192641 (2018).
- Saito, S., Adachi, N. Advances in the Development of Gene-Targeting Vectors to Increase the Efficiency of Genetic Modification. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 39 (1), 25-32 (2016).
- Langerak, P., Nygren, A., Schouten, J., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
- Martin, S. L., et al. A single amino acid substitution in ORF1 dramatically decreases L1 retrotransposition and provides insight into nucleic acid chaperone activity. Nucleic Acids Research. 36 (18), 5845-5854 (2008).
- Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Nucleic Acids Research. 33 (19), 173 (2005).
- Luo, Y., Bolund, L., Sørensen, C. B. Pig gene knockout by rAAV-mediated homologous recombination: comparison of BRCA1 gene knockout efficiency in Yucatan and Göttingen fibroblasts with slightly different target sequences. Transgenic Research. 21 (3), 671-676 (2012).
- Croning, M. D., Fricker, D. G., Komiyama, N. H., Grant, S. G. Automated design of genomic Southern blot probes. BMC Genomics. 11 (1), 74 (2010).
- Zimmer, A., Gruss, P. Production of chimaeric mice containing embryonic stem (ES) cells carrying a homoeobox Hox 1.1 allele mutated by homologous recombination. Nature. 338 (6211), 150-153 (1989).
