Identifikasjon av homologe rekombinasjon hendelser i mus embryonale stamceller Southern Blotting og polymerasekjedereaksjons
Summary
Her presenterer vi en detaljert protokoll for å identifisere homologe rekombinasjon hendelsene skjedde i mus embryonale stamceller bruker Southern blotting og/eller PCR. Denne metoden er eksemplifisert ved generering av nonmuscle myosin II genetisk erstatning musen modeller med tradisjonelle embryonale stamcelleforskningen-baserte homologe rekombinasjon-mediert teknologi.
Abstract
Forhold til saker av off-målet effekter og vanskelighetene med å sette inn en lang DNA-fragment i anvendelsen av designer nucleases for genomet redigering, embryonic stem (ES) cellebasert genet målretting teknologi har ikke disse svakhetene og mye brukes til å endre dyr/mus genomet mellom store slettinger/innsettinger single nukleotid erstatninger. Spesielt, ønsket identifisere relativt få homologe rekombinasjon (HR) hendelsene nødvendig for å oppnå ES kloner er et viktig skritt, som krever nøyaktig og pålitelig. Southern blotting og/eller konvensjonelle PCR benyttes ofte til dette formålet. Her beskriver vi detaljerte prosedyrer for å bruke disse to metodene til å identifisere HR hendelsene skjedde i musen ES celler som endogene Myh9 genet er ment å være forstyrret og erstattet av cDNAs andre nonmuscle myosin tunge kjeden IIs (NMHC IIs)-koding. Hele prosedyren for Southern blotting omfatter bygging av vector(s), electroporation, stoff utvalg, utvidelse og lagring av ES celler/kloner, forberedelse, fordøyelse og blotting genomisk DNA (gDNA), hybridization og Vask av probe(s), og en siste trinnet i autoradiography på X-ray filmer. PCR kan utføres direkte med forberedt og utvannet gDNA. For å oppnå perfekt resultat, bør sonder og begrensning enzym (RE) kutte nettsteder for Southern blotting og primere for PCR være nøye planlagt. Om gjennomføring av Southern blotting er tidkrevende og arbeidskrevende og PCR resultater har falske positiver, riktig identifikasjon av Southern blotting og rask screening av PCR tillater alene eller kombinert bruk av metodene beskrevet i denne utredningen å bli mye brukt og konsultert av de fleste laboratorier i identifikasjon av genotyper ES celler og genetisk endret dyr.
Introduction
Teknologien av genet målretting av HR i murine ES celler inneholder et kraftig verktøy for dissekere mobilnettet konsekvensene av bestemte genetiske mutasjoner1,2. Betydningen og betydningen av denne teknologien gjenspeiles i anerkjennelsen av 2007 Nobelprisen i medisin3,4; i mellomtiden representerer ankomsten av moderne tid genet engineering5. Gene målretting gjennom HR kan benyttes for å ingeniør nesten endringer mellom punkt mutasjoner store chromosomal rearrangements i genomet mus ES celler6,7. Det er velkjent at før fremveksten av såkalte genomet redigeringsverktøy, generering av genet knockout mus kreves bruk av genet målretting teknologi i ES celler8,9,10. I løpet av de siste to tiårene, ble mer enn 5000 genet målrettede mus produsert av denne tilnærmingen for modellering menneskelige sykdommer eller studere genet funksjoner11. En genomet hele knockout innsats er opprettet for å distribuere genet målretting vektorer, målrettet ES cellen kloner og levende mus til vitenskapelige samfunnet2,12,13,14 , 15. utvilsomt ES cellebasert HR-mediert genet målretting teknologien har sterkt avansert vår forståelse av funksjonene av gener i fysiologiske eller patologisk kontekst.
Fordi HR er en relativt sjelden hendelse i pattedyr celler16,17, viktig og neste trinn etter er genet målretting i murine ES celler å analysere mange ES koloniene for å identifisere noen kloner mutasjoner som følge av HR med målretting vektor18. Gull metodene for å identifisere HR hendelser inkluderer Southern blotting og PCR19,20. Fordelene med tilnærminger inkluderer at Southern blotting kan identifisere riktig målrettet ES kloner og tillater forskere å analysere strukturen i genet målrettede eventen en verifisering av en enkelt kopi innsetting av Konstruer, mens en PCR-basert strategi tillater rask screening for HR hendelser21,22. Selv om disse metodene har ulemper, slik at de er tidkrevende og kan har falske positiver, combinational bruk av dem er vidt akseptert og brukes av de fleste laboratorier identifisere HR hendelser, særlig i ES celler for generering av genetisk endret dyr.
Tre isoformene av nonmuscle myosin II (NM II) i pattedyr, hver bestående av to identiske NMHC IIs som kodes ved tre forskjellige gener (navngitt Myh9, Myh10 og Myh14) og to par lys kjeder, kalles NM II-A II-B og II-C23. Tidligere studier har indikert at minst isoformene NM II-A og II-B er avgjørende for musen utvikling fordi den i vivo ablation av disse isoformene gir embryonale dødelighet24,25,26. Å omgå dette problemet og få ny innsikt i isoformen-spesifikke funksjonene til NM II-A og II-B i senere stadier av musen utvikling, en genetisk erstatning strategi med ES cellebasert HR-mediert genet målretting teknologi ble vedtatt å generere en rekke musen modeller27. I løpet av identifisere ønsket ES kloner, både Southern blotting og PCR metoder ble brukt, og dette viste seg for å være effektive og pålitelige27,28.
Utredningen har til hensikt å gi en detaljert beskrivelse av Southern blotting og PCR, inkludert utforming av målretting vector(s), probe(s), og grunning og gjennomføring av eksperimenter og analyse av resultater eksemplifisert ved å identifisere HR hendelse forekomst i ES celler for å opprette genetisk erstatning NM II musen modeller og representant. Protokoller av disse to metodene presenteres her kan også vedtas for å identifisere genotyper genmodifiserte celleområde eller dyr.
Protocol
Representative Results
Discussion
Foreløpig erstatte designer nucleases for genomet redigering fortsatt ikke ES cellebasert genet målretting teknologi på grunn av sine problemer av off-målet effekter, og vanskeligheter med å sette inn en lang DNA fragment30,31. Som de gylne metodene for å identifisere HR hendelsene skjedde i musen ES celler, gir denne rapporten detaljert protokollen Southern blotting og PCR for feltet. Vi validert påliteligheten av disse metodene ved å analysere individue…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet fikk støtte fra General programmet av National Natural Science Foundation i Kina (tilskudd nr. 31571432), den menneskelige provinsielle Natural Science Foundation i Kina (Grant No. 2015JC3097) og den Research Foundation utdanning Bureau av Hunan Provinsen, Kina (Grant No. 15 K 054).
Materials
| BAC CLONE | BACPAC Resources Center (BPRC) | bMQ-330E21 | |
| QIAGEN Large-Construct Kit | QIAGEN | 12462 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit | QIAGEN | 12963 | |
| PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase | Agilent | 600382 | |
| T-easy vector | Promega | A1360 | |
| Nuclei Lysis Solution | Promega | A7941 | |
| Protein Precipitation Solution | Promega | A7951 | |
| DNA Denaturing Solution | VWR | 351-013-131 | |
| DNA Neutralizing Solution | VWR | 351-014-131 | |
| Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP) | VWR | 27-9240-01 | |
| UltraPure SSC, 20X | Thermo Fisher | 15557036 | |
| UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | 15593031 | |
| G418 | Thermo Fisher | 10131035 | |
| Salmon Sperm DNA Solution | Thermo Fisher | 15632011 | |
| Platinu Taq DNA Polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304029 | |
| Not I | Thermo Scientific | ER0592 | |
| Dra I | Thermo Scientific | ER0221 | |
| EcoR I | Thermo Scientific | ER0271 | |
| Ganciclovir | Sigma | G2536 | |
| Whatman TurboBlotter Transfer System, Large Kits | Fisher Scientific | 09-301-188 | |
| [α32P]dCTP | PerkinElmer | NEG013H100UC | |
| ProbeQuan G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | |
| Hybrisol I Hybridization Solution | Millipore | S4040 | |
| Kodak X-Ray Film | Z&Z Medical | 844 5702 |
References
- Gao, G., McMahon, C., Chen, J., Rong, Y. A powerful method combining homologous recombination and site-specific recombination for targeted mutagenesis in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 13999-14004 (2008).
- Skarnes, W., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337-342 (2011).
- Vogel, G. Nobel Prizes. A knockout award in medicine. Science. 318 (5848), 178-179 (2007).
- Salsman, J., Dellaire, G. Precision genome editing in the CRISPR era. Biochemistry. Cell Biology. 95 (2), 187-201 (2017).
- Capecchi, M. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nature Reviews Genetics. 6 (6), 507-512 (2005).
- Van, d. W. L., Adams, D. J., Bradley, A. Tools for targeted manipulation of the mouse genome. Physiological Genomics. 11 (3), 133-164 (2002).
- Glaser, S., Anastassiadis, K., Stewart, A. F. Current issues in mouse genome engineering. Nature Genetics. 37 (11), 1187 (2005).
- Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309 (5965), 255-256 (1984).
- Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature. 323 (6087), 445-448 (1986).
- Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51 (3), 503-512 (1987).
- Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337 (2011).
- Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), 9-13 (2007).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).
- Pettitt, S. J., et al. Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources. Nature Methods. 6 (7), 493-495 (2009).
- Gertsenstein, M., et al. Efficient Generation of Germ Line Transmitting Chimeras from C57BL/6N ES Cells by Aggregation with Outbred Host Embryos. PLoS One. 5 (6), 11260 (2012).
- Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal |[beta]|-globin locus by homologous recombination. Nature. 317 (6034), 230-234 (1985).
- Deng, C., Capecchi, M. R. Reexamination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeting vector and the target locus. Molecular & Cellular Biology. 12 (8), 3365 (1992).
- Lay, J. M., Friishansen, L., Gillespie, P. J., Samuelson, L. C. Rapid confirmation of gene targeting in embryonic stem cells using two long-range PCR techniques. Transgenic Research. 7 (2), 135-140 (1998).
- Langerak, P., Nygren, A. O. H., Schouten, J. P., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
- Gómezrodríguez, J., et al. Advantages of q-PCR as a method of screening for gene targeting in mammalian cells using conventional and whole BAC-based constructs. Nucleic Acids Research. 36 (18), 117 (2008).
- Kim, H. S., Smithies, O. Recombinant fragment assay for gene targeting based on the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Research. 16 (18), 8887-8903 (1988).
- Joyner, A. L., Skarnes, W. C., Rossant, J. Production of a mutation in mouse En-2 gene by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 338 (6211), 153-156 (1989).
- Ma, X., Adelstein, R. S. The role of vertebrate nonmuscle Myosin II in development and human disease. Bioarchitecture. 4 (3), 88-102 (2014).
- Malonek, D. Relationships between the dynamics of cortical blood flow, oxygenation, and volume changes following sensory stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, (1997).
- Takeda, K., Kishi, H., Ma, X., Yu, Z. X., Adelstein, R. S. Ablation and mutation of nonmuscle myosin heavy chain II-B results in a defect in cardiac myocyte cytokinesis. Circulation Research. 93 (4), 330-337 (2003).
- Conti, M. A., Evenram, S., Liu, C., Yamada, K. M., Adelstein, R. S. Defects in cell adhesion and the visceral endoderm following ablation of nonmuscle myosin heavy chain II-A in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41263-41266 (2004).
- Wang, A., et al. Nonmuscle myosin II isoform and domain specificity during early mouse development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (33), 14645-14650 (2010).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238 (2012).
- Liu, T., et al. Identification and characterization of MYH9 locus for high efficient gene knock-in and stable expression in mouse embryonic stem cells. PLoS One. 13 (2), 0192641 (2018).
- Saito, S., Adachi, N. Advances in the Development of Gene-Targeting Vectors to Increase the Efficiency of Genetic Modification. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 39 (1), 25-32 (2016).
- Langerak, P., Nygren, A., Schouten, J., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
- Martin, S. L., et al. A single amino acid substitution in ORF1 dramatically decreases L1 retrotransposition and provides insight into nucleic acid chaperone activity. Nucleic Acids Research. 36 (18), 5845-5854 (2008).
- Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Nucleic Acids Research. 33 (19), 173 (2005).
- Luo, Y., Bolund, L., Sørensen, C. B. Pig gene knockout by rAAV-mediated homologous recombination: comparison of BRCA1 gene knockout efficiency in Yucatan and Göttingen fibroblasts with slightly different target sequences. Transgenic Research. 21 (3), 671-676 (2012).
- Croning, M. D., Fricker, D. G., Komiyama, N. H., Grant, S. G. Automated design of genomic Southern blot probes. BMC Genomics. 11 (1), 74 (2010).
- Zimmer, A., Gruss, P. Production of chimaeric mice containing embryonic stem (ES) cells carrying a homoeobox Hox 1.1 allele mutated by homologous recombination. Nature. 338 (6211), 150-153 (1989).
