여기에 제시 된 분석 섬유 소 혈전 구조에 베타-아 밀 로이드의 효과 개별적으로 또는 조합에서 사용할 수 있는 두 가지 방법이 있습니다. 생체 외에서 섬유 소 혈전, 만드는 뒤에 병 탁도 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법 방법 포함 된 프로토콜이입니다.
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방법 논문
분광학 그리고 스캐닝 전자 현미경 검사 법에 의해 섬유 소 혈전 구조에 β 아 밀 로이드 유도 비정상의 분석
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
이 문서는 체 외 섬유 소 혈전 생성 및 분석 하 여 응고 형성 및 구조에 베타-아 밀 로이드 (Aβ) 단백질의 효과 분석 하 고 스캐닝 전자 현미경 (SEM)에 대 한 방법을 선물 한다. Aβ, Alzheimer의 질병 (광고)에서 신경 녹말 체 집계를 형성, fibrinogen 상호 작용을 보였다. 이 Aβ fibrinogen 상호 작용 구조적으로 비정상적인 fibrinolysis에 저항 하 고 섬유 소 혈전을 만든다. 섬유 소는 혈액 응고에 이상이 Aβ 유도 또한 microinfarcts, 같은 광고 병 리의 뇌혈관 측면에 기여할 수 있습니다 염증, 뿐만 아니라, 대뇌 아 밀 로이드 angiopathy (CAA). 광고 병리학 neurovascular 적자의 잠재적으로 중요 한 역할을 감안할 때, 유망한 치료 가치는 억제 또는 Aβ fibrinogen 상호 작용을 줄일 수 있는 화합물을 개발. 생체 외에서 메서드는 섬유 소에 의해 응고 형성 평가 될 수 있다 쉽고 체계적으로 치료 화합물 개발을 위한 잠재적으로 유용한 도구입니다. 여기는 섬유 소 혈전의 생성 생체 외에서 Aβ 및 Aβ fibrinogen 상호 작용 억제제의 효과의 분석에 대 한 최적화 된 프로토콜이입니다. 병 탁도 분석 결과 신속 하 고 매우 재현 이며 Aβ fibrinogen 억제제의 다 수의 심사에 대 한 수 있도록 여러 조건을 동시에, 테스트를 사용할 수 있습니다. 이 심사에서 히트 화합물 더 SEM.를 사용 하 여 섬유 소 혈전 아키텍처의 구조 이상 Aβ 유도 개량 하는 능력에 대 한 평가 이러한 최적화 된 프로토콜의 효과 TDI-2760, 최근 확인 된 Aβ fibrinogen 상호 작용 억제제를 사용 하 여 여기 보여 줍니다.
서론
Alzheimer의 질병 (광고), 신경 질환 노인 환자에서 인지 감소에 이어지는 주로 비정상적인 베타-아 밀 로이드 (Aβ) 식, 집계 및 장애인된 클리어런스 neurotoxicity1, 의 결과에서 발생 2. Aβ 집계 및 광고3사이 잘 특징이 협회에도 불구 하 고 근본적인 질병 병 리 정확한 메커니즘은 잘 이해4. 증거를 증가 제안 Aβ6순환 시스템 구성 요소와 직접 상호 작용으로 neurovascular 적자 진행 및 광고5, 심각도에 역할을 재생 합니다. Aβ는 fibrinogen7,8, 또한 광고 환자 및 마우스 모델9,,1011Aβ 예금 localizes와 높은 선호도 상호 작용. 또한, Aβ fibrinogen 상호 작용 fibrinol....
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프로토콜
1. 분석을 위한 Aβ42 및 Fibrinogen의 준비
- 동결 건조 된 분말에서 단위체 Aβ42 준비
- 1500 x g 30에 내려 실내 온도와 회전 Aβ42 분말을 따뜻한 s.
- Aβ42 분말의 0.5 밀리 그램 당 100 µ L의 얼음 hexafluoroisopropanol (HFIP)를 추가 하 고 얼음에 30 분 동안 품 어.
주의: HFIP을 처리할 때 주의 사용 하 고 화학 후드에 있는 모든 단계를 수행. - 20 µ L aliquots 고 영화 공기 건조에 2-3 헤 영화에 대 한 화학 후드-20 ° c.에 저장 될 수 있다 준비
- 실 온에서 10 분 동안 목욕 sonicator에 동요 하 여 신선한 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 10 µ L에서 단위체 Aβ42 영화를 다시 구성.
- 50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) 버퍼 (pH 7.4)의 190 µ L을 추가 하 고 부드럽게 위아래로 플라스틱.
- 20 분 동안 4 ° C에서 20,817 x g에서 원심 분리 하 여 단백질 집계를 제거 합니다.
- 4 ° C에서 상쾌한 하룻밤을 위해 품 어 고 다음날 원심 단백질 집계 더 이상 삭제....
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결과
시험관에 응고 (탁도) 분석 결과, 효소 트 롬 빈 섬유 소 네트워크24의 형성의 결과로 fibrinogen 앞. 이 섬유 소 혈전 형성 증가 탁도 (그림 1), (그림 2, 그린) 독서 기간의 끝 전에 頭 打 ち 상태에 따른 해결책을 통과 하는 빛의 산란을 발생 합니다. fibrinogen Aβ42의 알을 품는, 솔루션의 탁도 감소, 약 절반의 최대 높이 도달 하는 곡선 (그림 2A, 블루) 혼자 fibrinogen의. 최근 간행물에서 Aβ 집계 차단제의 시리즈는 합성 되었고 복합 TDI-276014식별 Aβ fibrinogen 상호 작용을 억제 하기 위해 그들의 능력에 대 한 평가. Aβ-fibrinogen .......
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토론
여기에 설명 된 방법을 섬유 소 혈전 형성에서 체 외에서평가의 재현성 및 빠른 수단을 제공 합니다. 또한, 시스템의 단순은 섬유 소 혈전 형성 및 구조 상대적으로 곧장 앞으로 미치는 Aβ의 해석. 이 연구소의 이전 게시, 그것은 화합물 Aβ fibrinogen 상호 작용13,14을 억제 하기 위해 그들의 능력에 대 한 테스트를 이러한 분석을 사용할 수 있는 표시 했다. 이 두 가지 분석 실험을 사용 하 여, 합성된 화합물의 시리즈 Aβ fibrinogen 상호 작용을 억제 하는 기능에 대 한 분석 했다. 실제로,로 Aβ fibrinogen 상호 작용을 억제할 수 있는 모든 화합물 섬유 소 혈전 형성을 복원할 수도 있습니다 치료 잠재력 하는 히트 화합물의 수영장을 좁히는 병 탁도 분석 결과 사용할 수 있습니다.
문제 해결을 요구 하거나이 기술의 사용을 제한 하는.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
저자 마사 노리 가와사키가 즈 요 시 아소, 그리고 마이클 폴 리 트라이 기관 치료제 발견 연구소 (TDI), Aβ-fibrinogen 상호 작용 억제제의 합성에 대 한 뉴욕 및 그들의 귀중 한 제안에서 감사합니다. 저자는 또한 유용한 토론에 대 한 스 트 릭 랜드 연구소의 회원을 감사합니다. 이 작품에 의해 지원 되었다 NIH 그랜트 NS104386, 질병의 약물 발견 재단, 그리고 로버트 슨 치료 개발 기금 랭에 대 한 NIH 부여 NS50537, 트라이 기관 치료제 디스커버리 연구소 Alzheimer 약물 발견 재단, Rudin 가족 재단과 S.S.의 존 A. 에르난데스
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 피브리오겐, 플라스미노겐 고갈, 플라즈마 | EMD Millipore | 341578 | 수분 노출을 피하기 위해 뚜껑 파라필름을 감싸서 보관 |
| 베타-아밀로이드(1-42), 인간 | Anaspec | AS-20276 | |
| 트롬빈 | Sigma-Aldrich | T7009 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, 99% | Sigma-Aldrich | 105228 | |
| 디메틸설폭사이드(DMSO), 멸균 여과 | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Pierce BCA 단백질 분석 키트 | Thermo Scientific | 23225 | |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152 | |
| HEPES | Fischer Scientific | BP310 | |
| NaCl | Fischer Scientific | S271 | |
| CaCl2 | Fischer Scientific | C70 | |
| 필터 주사기, 0.2µ M, 25mm | Pall | 4612 | |
| Millex 멸균 주사기 필터, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia. | Millipore | SLVV033RS | |
| Solid 96 웰 플레이트, 높은 바인딩 인증 플랫 바텀, | Fischer Scientific | , 21377203 | |
| Spectramax Plus384 | Molecular Devices | 89212-396 | |
| Centrifuge, 5417R, | Eppendorf | 5417R | |
| , Branson 200 초음파 세척기, | Fischer Scientific | 15-337-22 | |
| Lab Rotator | Thermo Scientific | 2314-1CEQ | |
| 커버 슬립 홀더용 예비 와셔 | Tousimis | 8766-01 | |
| 좁은 줄기 피펫 - Sedi-Pet | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70967-13 | |
| CPD용 시료 홀더(커버 슬립 홀더) | Tousimis | 8766 | |
| 마운트 홀더 박스, 핀형 | 전자 현미경 과학(EMS) | 76610 | |
| 원형 유리 커버 슬라이드(12mm) | Hampton Research | HR3-277 | |
| 10% 글루타르알데히드 | 전자 현미경 과학(EMS) | 16120 | |
| 에탄올 | Decon Labs | 11652 | |
| 24 웰 플레이트 | Falcon | 3047 | |
| Na Cacodylate | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 11652 | |
| SEM 스텁, 테이퍼 엔드 핀. | 전자 현미경 과학 (EMS) | 75192 | |
| PELCO 탭, 탄소 전도성 탭, 12mm OD | Ted Pella | 16084-1 | |
| Autosamdri-815 임계 점 건조기 | Tousimis | ||
| Denton Desk IV Coater with Gold / Palladium Target | Denton Vacuum | ||
| Leo 1550 FE-SEM | Carl Zeiss | ||
| Smart SEM Software | 칼 자이스 |
참고문헌
- Selkoe, D. J., Schenk, D. Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).
- Kurz, A., Perneczky, R. Amyloid cleara....
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