En In Vitro -modell av ett parallell-plattan Perfusion System att studera bakteriell vidhäftning för att ympa vävnader
Summary
Vi beskriver en egen designade in vitro- flöde kammare modell, vilket gör att utredningen av bakteriell adherencen till ympa vävnader.
Abstract
Olika vätskeserien conduits och stent-monterade ventiler används för höger kammare utflöde tarmkanalen (RVOT) ventil ersättning hos patienter med kongenital hjärtsjukdom. När du använder protetiska material emellertid, är dessa transplantat mottagliga för bakterieinfektioner och olika värd svaren.
Identifiering av bakteriell och värd faktorer som spelar en viktig roll i endovaskulär följsamhet av mikroorganismer är av betydelse att bättre förstå patofysiologin bakom uppkomsten av infektioner som endokardit (IE) och att utveckla förebyggande strategier. Därför behövs utveckling av behöriga modeller att undersöka bakteriell vidhäftning fysiologiska skeva villkor. Här, beskriver vi användningen av en nydesignade in vitro- perfusion kammare baserat på parallella plattor som gör studien av bakteriell vidhäftning till olika komponenter av transplantat vävnader såsom synliga extracellulärmatrix, endotelceller och inert områden . Denna metod kombineras med kolonibildande enhet (CFU) räknar är tillräcklig för att utvärdera transplantat material benägenhet mot bakteriell vidhäftning under flöde. Ytterligare kan på, flöde kammare systemet användas för att undersöka betydelsen av blodkomponenter i bakteriell vidhäftning skeva villkor. Vi visat att källan till vävnad, deras ytan morfologi och bakteriearter specificitet inte är de stora avgörande faktorerna i bakteriell adherencen till ympa vävnader med hjälp av vår egen designade i vitro perfusion modell.
Introduction
Staphylococcus aureus (S. aureus) sysselsätter en mängd virulens strategier att kringgå immunförsvar värdsystemet kolonisera biologiska eller icke-biologiska ytor som implanteras i mänskliga cirkulationen, vilket leder till allvarlig intravaskulär infektioner såsom sepsis och IE1,2,3,4,5. IE förblir en viktig behandling associerade komplikation hos patienter efter implantation av hjärtklaffprotes medan enskilda faktorer som bidrar till uppkomsten av IEare inte ännu fullt förstådd6,7. Under flödesförhållanden möter bakterier skeva styrkor, som de måste övervinna för att hålla sig till fartygets vägg8. Modeller, som tillåter att studera samspelet mellan bakterier och protes ventil vävnad eller endotel under flöde, är av intresse då de avspeglar i vivo situationen mer.
Flera specifika mekanismer underlätta bakteriell vidhäftning till endotelceller (ECs) och den exponerade subendothelial matrix (ECM) leder till vävnad koloniseringen och mognaden av vegetation, att vara viktiga tidiga steg i IE9. Olika staphylococcal ytproteiner eller MSCRAMMs (mikrobiell ytan komponenter erkänner limmatris molekyler) har beskrivits som medlarear av vidhäftning till värdceller och ECM proteiner genom att interagera med molekyler såsom Fibronektin, fibrinogen, kollagen och von Willebrand faktor (VWF)8,10,11. Dock med tanke på inom molekylär vikning av vissa virulensfaktorer, mestadels studerade i statiska förhållanden, kan många av dessa interaktioner ha olika betydelse i endovaskulär infektioner i cirkulerande blod.
Därför presenterar vi en egen designade in vitro- parallell-plattan kammare modell för flödet, vilket gör bedömningen av bakteriell vidhäftning till olika komponenter i ECM och ECs i samband med vävnad ympkvistar implanteras i RVOT position. Det övergripande syftet med den metod som beskrivs i detta arbete är att studera mekanismer i samspelet mellan bakterier och underliggande endovaskulär vävnader i flödet villkorar, som är nära relaterade till den in-vivo -miljön i blodomloppet patogener såsom S. aureus. Denna nya strategi fokuserar på känslighet av transplantat vävnaden ytor till bakteriell vidhäftning att identifiera potentiella riskfaktorer för utveckling av IE.
Protocol
Representative Results
Discussion
Senaste kliniska observationer ge särskilda medvetenhet till IE som en komplikation hos patienter som genomgått ventil ersättning av RVOT6,13. Dysfunktion av implanterade ventilen i IE är resultatet av bakteriell interaktion med endovaskulär graften leder till omfattande inflammatoriska och prokoagulanta reaktioner1,14. Presenterade nya in vitro- modellen tillät oss att undersöka om skilln…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie var sponsrad av ett bidrag på den forskning fonden KU Leuven (OT/14/097) ges till RH. TRV var postdoktor för CVE Research Foundation – Flandern (Belgien. Bevilja nummer – 12K0916N) och RH stöds av kliniska forskning fonden UZ Leuvens.
Materials
| Bovine Pericardium (BP) patch, Supple Peri-Guard Pericardium | Synovis Surgical Innovations, USA | PC-0404SN | |
| Bovine Jugular Vein conduits (BJV) | Contegra conduit; Medtronic Inc, USA | M333105D001 | |
| CH cryopreserved homograft | European Homograft Bank (EHB) | – | |
| Acu-Punch | Acuderm Inc, USA | P850 (8 mm); P1050 (10 mm) | |
| human Albumin | Flexbumin; Baxter, Belgium | BE171464 LOT:16G12C |
|
| Tryptic soy broth (TSB) | Fluka, Steinheim, Germany | 22092-500G | |
| Heart infusion broth (BHI) | Fluka | 53286-500G | |
| Phosphate buffered saline (PBS). | Gibco | 14190-094 | |
| 5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF) | Sigma-Aldrich, Germany | 21878-100MG-F | |
| Peristaltic pump (MODEL ISM444B) | Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germany | 631942-2 | |
| Sonication bath | VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, Radnor, Pa | 142-6044 | 230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen by ThermoFisher | P36930 | |
| InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner) | GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa | 29027886 | |
| Arium Pro VF – ultrapure water – H2O MilliQ | Millipore | 87206462 | |
| Microscopic slides – Tissue Culture Chambers (1-well) | Sarstedt | 94.6140.102 | |
| 1-well on Lumox detachable | Sarstedt | 94.6150.101 | |
| Stainless Steel – surgical Blades | Swann-Morton | 311 | |
| Tygon Silicone Tubing, 1/8"ID x 1/4"OD | Cole-Parmer | EW-95702-06 | Temperature range: –80 to 200°C Sterilize: With ethylene oxide, gamma irradiation, or autoclave for 30 min, 15 psi of pressure |
| PharMed BPT Tubing | Saint-Gobain | AY242012 | Autoclavable 30 min at 121°C |
| Tygon LMT-55 Tubing | Saint Gobain Performance Plastics™ | 15312022 | |
| Thermostat | BMG BIOMEDIZINTECHNIK | 300-0042 | 230V, 90VA, 50Hz |
References
- Que, Y. A., Moreillon, P. Infective endocarditis. Nature Reviews Cardiology. 8 (6), 322-336 (2011).
- Werdan, K., et al. Mechanisms of infective endocarditis: pathogen-host interaction and risk states. Nature Reviews Cardiology. 11 (1), 35-50 (2014).
- Moreillon, P., Que, Y. A. Infective endocarditis. The Lancet. 363 (9403), 139-149 (2004).
- Jalal, Z., et al. Selective propensity of bovine jugular vein material to bacterial adhesions: An in vitro study. International Journal of Cardiology. 198, 201-205 (2015).
- Sharma, A., Cote, A. T., Hosking, M. C. K., Harris, K. C. A Systematic Review of Infective Endocarditis in Patients With Bovine Jugular Vein Valves Compared With Other Valve Types. JACC Cardiovascular Interventions. 10 (14), 1449-1458 (2017).
- Malekzadeh-Milani, S., et al. Incidence and predictors of Melody(R) valve endocarditis: a prospective study. Archives of Cardiovascular Diseases. 108 (2), 97-106 (2015).
- Hill, E. E., et al. Management of prosthetic valve infective endocarditis. American Journal of Cardiology. 101 (8), 1174-1178 (2008).
- Claes, J., et al. Clumping factor A, von Willebrand factor-binding protein and von Willebrand factor anchor Staphylococcus aureus to the vessel wall. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (5), 1009-1019 (2017).
- Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European Journal of Cell Biology. 79 (10), 672-679 (2000).
- Patti, J. M., Hook, M. Microbial adhesins recognizing extracellular matrix macromolecules. Current Opinion in Cell Biology. 6 (5), 752-758 (1994).
- Massey, R. C., et al. Fibronectin-binding protein A of Staphylococcus aureus has multiple, substituting, binding regions that mediate adherence to fibronectin and invasion of endothelial cells. Cellular Microbiology. 3 (12), 839-851 (2001).
- Jashari, R., et al. Belgian and European experience with the European Homograft Bank (EHB) cryopreserved allograft valves–assessment of a 20 year activity. Acta Chirurgica Belgica. 110 (3), 280-290 (2010).
- Cheatham, J. P., et al. Clinical and hemodynamic outcomes up to 7 years after transcatheter pulmonary valve replacement in the US melody valve investigational device exemption trial. Circulation. 131 (22), 1960-1970 (2015).
- Que, Y. A., et al. Fibrinogen and fibronectin binding cooperate for valve infection and invasion in Staphylococcus aureus experimental endocarditis. The Journal of Experimental Medicine. 201 (10), 1627-1635 (2005).
- Veloso, T. R., et al. Bacterial adherence to graft tissues in static and flow conditions. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (1), 325-332 (2018).
- Liesenborghs, L., Verhamme, P., Vanassche, T. Staphylococcus aureus, master manipulator of the human hemostatic system. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (3), 441-454 (2018).
- Chiu, J. J., et al. Shear stress increases ICAM-1 and decreases VCAM-1 and E-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells. Artheriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (1), 73-79 (2004).
- Jockenhoevel, S., Zund, G., Hoerstrup, S. P., Schnell, A., Turina, M. Cardiovascular tissue engineering: a new laminar flow chamber for in vitro improvement of mechanical tissue properties. ASAIO Journal. 48 (1), 8-11 (2002).
- Veltrop, M. H. A. M., et al. Bacterial Species- and Strain-Dependent Induction of Tissue Factor in Human Vascular Endothelial Cells. Infection and Immunity. 67 (11), 6130-6138 (1999).
