Summary

移植組織の細菌付着を勉強する平行平板灌流システムのIn Vitroモデル

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

私たちは、社内に設計された体外流れ商工会議所モデル、移植組織の細菌付着の検討を可能にするについて説明します。

Abstract

様々 なバルブ付き導管とステントに取り付けられたバルブは、先天性心疾患患者における右室流出路 (慢性) 弁置換に使用されます。しかし補綴用材料を使用して、これらの移植が細菌感染と様々 な宿主反応を受けやすいです。

重要な役割を果たす微生物の血管内付着細菌とホスト因子の同定が重要である感染性心内膜炎 (IE) などの感染症の発症の病態生理を理解し、予防を開発するには戦略。そのため、生理学的せん断条件下で細菌の付着を調査する有能なモデルの開発が必要です。ここでは、新しく設計された体外灌流チャンバー平行平板に基づく移植組織のさまざまなコンポーネントへの細菌付着に関する研究など細胞外マトリックス、内皮細胞および不活性領域を公開することができますの使用について述べる.このメソッドはコロニー形成と組み合わせるユニット (CFU) カウントは移植材の流れの下で細菌の粘着の方の傾向を評価する適切な。さらに、流れ溜まりされる可能性がありますせん断条件下で細菌の付着の血液成分の役割を調査するため。我々 は、組織、形態、および菌種特異性のソースは当社社内に設計された体外灌流モデルを用いた組織を移植への細菌付着の主要な決定要因ではないことを示した。

Introduction

黄色ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌) は、さまざまな病原性敗血症など重症の血管内感染につながる人間の循環注入生物や非生物の表面を植民地化ホストの免疫の防衛システムを回避する戦略を採用していて、IE1,2,3,4,5。IE のまま患者の IEare の発症に貢献することの個々 の要因がまだ完全に理解6,7人工心臓弁の移植後合併症が重要な治療に関連付けられています。流れの条件の下で細菌が発生せん断力容器壁8に準拠するために克服する必要があります。彼らはより多くの体内の状況を反映して、流れの下で血管内皮細胞や人工弁組織細菌間の相互作用を研究することで、モデル、関心です。

いくつかの特定のメカニズムは、血管内皮細胞 (Ec) へと組織の植民地化と植生、IE9の重要な初期の手順の中の成熟に至る露出内皮下マトリックス (ECM) に細菌の付着を促進します。様々 なブドウ球菌表面蛋白または MSCRAMMs (認識性接着剤マトリックス分子微生物表面部材) が, フィブロネクチンなどの分子との相互作用によって宿主細胞と ECM タンパク質の付着仲介人として記載されています。フィブリノーゲン、コラーゲン、フォン ・ ヴィレブランド因子 (VWF)8,10,11。ただし、大抵静的な条件で研究のいくつかの病原因子の分子内折りたたみの観点からこれらの相互作用の多くは循環血液中血管内感染の異なる関連性にあります。

本稿で、社内に設計された体外平行平板流チャンバー モデル、慢性位置に注入する組織移植のコンテキストで ECM と ECs のさまざまなコンポーネントへの細菌付着の評価を可能にします。この作品で説明されているメソッドの全体的な目的は細菌やよう血液中の病原体の生体内環境に密接に関連の流れの条件の基になる血管内の組織間の相互作用のメカニズムを研究するには黄色ブドウ球菌。この斬新なアプローチは、IE の開発のための潜在的なリスク要因を識別するために細菌の付着を移植組織表面の感受性に焦点を当てています。

Protocol

1.体外研究移植組織の準備 注: 組織の 3 つのタイプは使用された: ウシ心膜パッチ (BP)、凍結保存同種 (CH) および牛の頚静脈移植 (BJV)。BJV 導管、CH (組織処理欧州同種銀行 (エッブ) によって、液体窒素を使用する前に格納されている) の場合は、壁と弁のリーフレットの両方が使用されました。BP パッチと BJV 電線管は、メーカーから購入しました。使用前に次のエッ?…

Representative Results

背後にあるメカニズムを理解するIE の開発、このモデルにより、細菌の評価と感染症発症の体内状況に存在する関連付けられた組織因子。 詳しくは、新規体外アプローチにより、3-10 ダインの生理的な範囲でせん断応力を発揮する組織に蛍光に分類された細菌を灌によって異なる移植組織へのフロー条…

Discussion

最近の臨床所見は、慢性6,13の弁置換術を受けた患者における合併症として IE に特別な意識を与えます。IE で注入弁の機能不全は、広範な炎症と凝血促進反応1,14につながる血管グラフトと細菌の相互作用の結果です。提示された新規の in vitroモデルでは、組織構造および細菌性因子の相違が生?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

本研究は、RH に与えられた研究基金ルーヴェン (OT/14/097) の助成金によって後援されました。TRV は FWO 研究財団 – フランダース (ベルギー; 博士研究員許可番号 – 12K0916N) と RH は UZ ルーヴェン臨床研究基金でサポートされます。

Materials

Bovine Pericardium (BP) patch, Supple Peri-Guard Pericardium Synovis Surgical Innovations, USA PC-0404SN
Bovine Jugular Vein conduits (BJV) Contegra conduit; Medtronic Inc, USA M333105D001
CH cryopreserved homograft European Homograft Bank (EHB)
Acu-Punch Acuderm Inc, USA P850 (8 mm); P1050 (10 mm)
human Albumin Flexbumin; Baxter, Belgium BE171464
LOT:16G12C
Tryptic soy broth (TSB) Fluka, Steinheim, Germany 22092-500G
Heart infusion broth (BHI) Fluka 53286-500G
Phosphate buffered saline (PBS). Gibco 14190-094
5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF) Sigma-Aldrich, Germany 21878-100MG-F
Peristaltic pump (MODEL ISM444B) Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germany 631942-2
Sonication bath VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, Radnor, Pa 142-6044 230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W
ProLong Gold Antifade Mountant Invitrogen by ThermoFisher P36930
InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner) GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa 29027886
Arium Pro VF – ultrapure water – H2O MilliQ Millipore 87206462
Microscopic slides – Tissue Culture Chambers (1-well) Sarstedt 94.6140.102
1-well on Lumox detachable Sarstedt 94.6150.101
Stainless Steel – surgical Blades Swann-Morton 311
Tygon Silicone Tubing, 1/8"ID x 1/4"OD Cole-Parmer EW-95702-06 Temperature range: –80 to 200°C
Sterilize: With ethylene oxide, gamma irradiation, or autoclave for 30 min, 15 psi of pressure
PharMed BPT Tubing Saint-Gobain AY242012 Autoclavable 30 min at 121°C
Tygon LMT-55 Tubing Saint Gobain Performance Plastics™ 15312022
Thermostat BMG BIOMEDIZINTECHNIK 300-0042 230V, 90VA, 50Hz

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Cite This Article
Ditkowski, B., Veloso, T. R., Bezulska-Ditkowska, M., Lubig, A., Jockenhoevel, S., Mela, P., Jashari, R., Gewillig, M., Meyns, B., Hoylaerts, M. F., Heying, R. An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues. J. Vis. Exp. (143), e58476, doi:10.3791/58476 (2019).

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