가 여러 명의 병렬 접시 흐름 챔버를 사용 하 여 스트레스에 노출 된 내 피 세포의 유전자 표정 분석
Summary
여기, 유체 전단 응력에서 내 피 세포의 문화 및 유전자 표정 분석에 대 한 워크플로 제공 됩니다. 포함 된 동시에 주택 및 제어 환경에 양이 많은 PCR에 대 한 참조 외 인 RNA 사용 하 여 여러 흐름 챔버 모니터링에 대 한 물리적 배열이입니다.
Abstract
우리는 여러 모니터링된 병렬 플레이트 흐름 챔버를 사용 하 여 지속적인 층 흐름에 따라 내 피 세포에서 유전자 발현의 분석에 대 한 워크플로 설명 합니다. 내 피 세포는 혈관의 내벽 세포를 형성 하 고 만성 혈 라는 전단 응력 마찰력에 노출 되는. 생리 적 조건, 내 피 세포 기능 다양 한 전단 응력 조건 존재. 따라서, 생체 외에서 모델에 전단 응력 조건의 응용 프로그램 내 피 응답 비보에 큰 통찰력을 제공할 수 있습니다. 병렬 플레이트 흐름 챔버 레인 외. 이전 출판 9 는 존재 및 지속적인 (비 타악기) 층 흐름의 부재에 내 피 유전자 규칙을 공부에 적응. 여기에 제시로 층 류 흐름에 대 한 설정에 있는 주요 적응 포함 집 동시 흐름 회로, 유량에서의 모니터링에 큰, 전용 환경 실시간, 고는 외 인 RNA에 대 한 참조는 정규화의 포함 양이 많은 실시간 PCR 데이터입니다. 전단 응력의 응용 프로그램과 함께 여러 치료/조건을 평가 하기 위해 여러 흐름 회로 및 펌프 사용 됩니다 동시에 같은 온수 및 humidified 인큐베이터 내에서. 각 흐름 회로의 유량에 지속적으로 측정 하는 실험을 통해 전단 응력 조건 표준화 실시간. 이러한 실험 여러 조건 때문에, 우리는 또한 RNA 추출 및 첫번째 물가 cDNA 합성 효율성의 정규화에 대 한 RNA 추출 시 아군에 있는 외 인 참조 RNA를 사용 합니다. 이 단계 샘플 사이 가변성을 최소화합니다. 이 전략은 병렬 플레이트 흐름 챔버를 사용 하 여 전단 응력 실험 유전자 표정 분석에 대 한 우리의 파이프라인 고용 하지만 외 인 등이 전략의 부분 참조 RNA 스파이크, 쉽게 및 비용 효율적으로 사용할 수 다른 응용 프로그램입니다.
Introduction
혈관 내 피 세포는 높은 종의 닫히는 심장 혈관 시스템에 혈관의 내벽 세포를 형성합니다. 그들은 혈액과 조직 사이의 인터페이스를 형성 하 고 luminal 특징으로하 고 abluminal 표면. Endothelium 혈액 흐름, 영양소 밀매, 내성 및 새로운 혈액 혈관1의 성장을 조절 하는 다양 한 활동과 적응 시스템입니다. 본문에 내 피 세포는 순환, 전단 응력2의 마찰력에 노출 되는 환경에서 일반적으로 존재 한다. 전단 응력은 내 피 세포 유전자 식3의 중요 한 레 귤 레이 터 그리고 내 피 세포가 주어진된 범위2,4내의 전단 응력을 유지 하려고. 내 피 세포 신생 조직 관류를 향상 시킬 수 있는 전단 응력5 의 부재에 패턴을 보여 줍니다. 방해 흐름 및 변경 된 전단 응력의 지역 패턴 자극적인 유전자6 의 표현과 롬7,8의 개발에 관련이 있습니다. 따라서, 전단 응력을 포함 하는 모델 내 피 유전자 규칙 이해의 주요 구성 요소입니다.
전단 응력에서 혈관 내 피 세포에서 유전자 규칙을 공부 하는 방법을 설명 합니다. 이 시스템 비 타악기 흐름을 사용 하 고 그 모델 조건 동맥 내 피 세포에 대 한 유체 전단 응력 수준 및 산소 농도 모방. 이 프로토콜 RNA 간섭 (RNAi), 전단 응력에 의해 분석 전에 exogenous 참조 RNA의 스파이크에 대 한 병렬 플레이트 흐름 장치 및 방법을 사용 하 여 응용 프로그램에 대 한 설정을 사용 하 여 유전자 최저에 대 한 방법의 세부 사항을 포함 역전사 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-정량). 이 파이프라인 존재 및 층 류 전단 응력의 부재에 내 피 세포에서 유전자 규칙을 공부 하 고 사용 하 고 레인 외 에 의해 설명 된 병렬 플레이트 흐름 장치의 적응을 포함 9.이 특정 설정 전단 응력 조건의 직접 비교 뿐만 아니라 RNA 분석의 정상화를 허용 하는 여러 실험 조건의 동시 평가 촉진 하도록 설계 되었습니다. 제어 습도 대형 온수 장치는 여러 별도 흐름 챔버와 펌프 유량 실시간으로 각 흐름 챔버 어셈블리에 대 한 감시와 함께 동시에 실행 되는 것을 허용 하도록 이용 된다. 이 설정의 응용 프로그램은 유전자 최저 층 류/전단 응력의 설정에서 RNAi를 사용 하 여 사용 하지만이 프로토콜의 RNA 식의 어떤 평가에 적용할 수 있습니다.
내 피 세포에 대 한 전단 응력의 응용 프로그램에 일반적인 접근 등 미세 시스템10, 콘 판 점도 계11, 병렬 플레이트 흐름 챔버12. 다양 한 제조 업체에서 미세 시스템 mechanobiology 및 mechanotransduction 여러 셀 조직 형식 및 생물 자극의 다양 한 공부에 도움이 되었습니다. 내 피 세포에 대 한 그들은 고립으로 내 피 세포의 상호 작용 및 면역 또는 종양 세포10의 인신 매매에 내 피 세포를 공부 사용 되었습니다. 그러나, 이러한 시스템은 셀9의 많은 수의 복구를 위해 보다 적게 적당 하다. 콘 판 점도 계 및 병렬 플레이트 흐름 챔버 confluent monolayers12셀의 많은 수의 복구를 허용 한다. 이러한 시스템은 전단 세력 및 패턴12의 범위를 생성할 수 있습니다. 병렬 플레이트 흐름 챔버 어셈블리9 장점이 그 실시간 이미징 시간 언제 든 지 세포 형태를 평가 하 유리 창을 통해 수행할 수 있습니다. 또한, perfusate는 무 균 조건 하에서 수집할 수 있습니다. 여기에 제시 된 시스템에 대 한 흐름 또한 모니터링할 수 있습니다 실시간으로 챔버 사이 전단 조건의 유지 보수를 용이 하 게 멀티 챔버 설정.
대표적인 실험에 대 한 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVEC), macrovascular 내 피 세포 종류를 나타내는 데 사용 됩니다, 그리고 우리가 사용 하는 전단 응력 조건 (1 Pa) 동맥 조건 반영 (0.1-0.7 Pa). 그러나, 다른 내 피 세포 유형,이 프로토콜을 사용할 수 있습니다 그리고 전단 응력 조건 실험 질문에 따라 조정 될 수 있다. 예를 들어 정 맥 순환 모델 조건에서 인간의 내 피 세포의 전단 응력 (1-6 Pa)의 낮은 수준이 필요로 및 microvascular 순환 모델 연구의 0.4-전단 스트레스 수준을 활용 1.2 Pa13 , 14. 또한, 전단 응력도 같은 혈관6내 내 피 세포 사이 다를 수 있습니다. 현재 설정에서 단일 모니터링 시스템은 사용 되는 동시에 4 개의 별도 흐름 루프를 모니터링할 수 있습니다. 더 많은 흐름 루프를 필요로 하는 연구소에 대 한 추가 모니터링 시스템에 대 한 전용된 환경에서 공간이입니다.
실시간 정량 Pcr는 전단 응력의 설정에서 유전자 발현의 절대 정량에 사용 됩니다. 대상 유전자의 상대적 표현은 자주 조건에서 RNA 식을 비교 하는 데 사용 됩니다. 일부 RNA 종 매우 낮은 수량에 존재 하거나 결 석, 따라서 상대 측정을 복잡 하 게 될 수 있습니다. 예를 들어 내 피 세포에서 긴 noncoding RNAs 셀5당 상대적으로 낮은 복사 번호에 강력한 효과 발휘 수 있습니다. 또한, 뇌관 효율에 차이가 발생할 수 있습니다 부정확 한 해석에서 델타-델타 주기 임계값 (Ct) 메서드를 이용 하 여 데이터를 분석 하. 이 문제를 해결 하기 위해 우리는 알려진된 양의 플라스 미드 DNA 사용 하 여 표준 곡선을 생성 하 여 절대 정량을 수행 합니다. 또한, 상호 보완적인 DNA (cDNA) 합성 비효율적인 프로세스 이며 cDNA 효율에서 차이 RNA 식 및 샘플15조건 사이의 차이 대 한 계정 수 있습니다. 전단 응력 transfection 시 약의 응용 세포 증식, apoptosis, 및 생존 능력에 영향을 하거나 RNA 격리 또는 cDNA 합성을 방해할 수 있는 구성 요소를 추가할 수 있습니다. RNA 격리 및 cDNA 합성에서 바이어스의 가능성에 대 한 계정, 우리는 스파이크에서 RNA 제어 실험실에서 합성, RNA 추출 시 추가 및 각 cDNA 합성을 통해 실시간 정량 측정 사용 합니다. 이로써 조정 뿐만 아니라 기술 차이 RNA 추출 및 cDNA 합성에서 하지만 또한 셀 수가 알려진 경우 셀 당 절대 수량 계산을 수 있습니다.
이 시스템은 유사성을 유지 하거나 조건 간의 기술적인 차이 대 한 계정에 추가 단계를 사용 합니다. 우리는 특히 여러 물리적 설정 및 실험적인 다양성으로 이어질 수 있는 실험 조건을 포함 하는 이러한 실험의 복잡 한 특성으로 인해 이러한 단계를 강조.
Protocol
Representative Results
Discussion
전단 응력은 정상 유전자 식2,5에 영향을 미치는 하 여 내 피 기능 일부를 변조 하는 생리 조건. 다양 한 전단 응력 조건에서 유전자 규칙의 모델은 내 피 기능에 대 한 더 큰 이해에 기여할 것입니다. 이 실용적인 워크플로 병렬 플레이트 흐름 챔버 레인 외. 에서 적응을 사용 하 여 흐름 회로 포함 층 류, 비 타악기 흐름 9 고 나타?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 CIHR 청소 142307 P.A.M. 의해 지원 되었다 H.S.J.M. 캐나다 연구소의 건강 연구 훈련 프로그램 재생 의학 화목에서의 받는 사람입니다. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K., 및 M.K.D.는 과학 기술에 퀸 엘리자베스 II 대학원 장학금을 받는 사람.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | gibco | 25300-062 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 10 mm2 Culture Dish | Sarstedt | 83.3902 | |
| 30 mL Syringe | BD | 302832 | |
| 4-Way Stopcocks | Discofix | D500 | |
| Aluminum foil | |||
| BEACH | Darwin Chambers Company | MN: HO85, SN: 4947549 | |
| Cell Scrapers | |||
| CO2 Meter | BioSphenix, Ltd. | MN: P120, SN: 0342 | |
| CO2 Sensor | BioSphenix, Ltd. | MN: C700, SN: 52852 | |
| Distilled water | gibco | 15230-170 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) -/- | gibco | 14190-144 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | Promo Cell | C-22011 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix | Promo Cell | C-39216 | |
| Fibronectin (pure) | Sigma-Aldrich | 11051407001 | |
| Filter (0.20 um) | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Flow Dampener and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Meter: 400 Series Console | Transonic Scisense Inc. | T402 | |
| Flow Meter: 400 Series Tubing | Transonic Scisense Inc. | TS410 | |
| Flow Reservoir and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Sensor | Transonic Scisense Inc. | ME4PXL | |
| Isotemp 737F Oven | Fisher Scientific | FI-737F | |
| J cloth | J cloth | ||
| Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm) | Fisherfinest | 12-544-4 | |
| Paper sterilization pouch | Cardinal Health | 92713 | |
| Pump (Masterflex L/S Economy Drive) | Cole-Parmer | 7554-90 | |
| Pump Head (Masterflex L/S Easy Load) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| Rectangular 4 Well Dish | Thermo Scientific | 267061 | |
| Tweezers | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tubing | |||
| Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-25 | |
| Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-14 | |
| Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-16 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-13 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-14 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luer | |||
| 3/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-08 | For #25 tubing |
| 1/8" Male Luer | Cole-Parmer | 30800-24 | For #16 tubing |
| 1/8" Female Luer | Cole-Parmer | 30800-08 | For #16 tubing |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-00 | For #14 tubing |
| 1/16" Female Luer | Cole-Parmer | 45508-00 | For #14 tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockdown reagents | |||
| Oligofectamine Reagent | Invitrogen | 12252-011 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | gibco | 31985-070 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In vitro transcription | |||
| Generuler 1kb+ DNA ladder | Thermo Scientific | SM1331 | |
| MEGAclear Kit | Ambion | AM1908 | |
| mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| pSP-luc+ | Promega | E4471 | |
| Supercoiled DNA Ladder | New England BioLabs Inc. | N0472S | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| UltraPure Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585011 | |
| XhoI Restriction Enzyme | New England BioLabs Inc. | R0146S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction | |||
| Beta-mercaptoethanol | Sigma | M3148-100mL | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
References
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