Análisis de expresión génica de las células endoteliales expuestas a estrés mediante múltiples cámaras de placas paralelas flujo del esquileo
Summary
Aquí, se presenta un flujo de trabajo para el análisis de expresión cultura y genes de células endoteliales bajo tensión de esquileo líquido. Incluido es un arreglo físico para simultáneamente y monitoreo de múltiples cámaras de flujo en un entorno controlado y el uso de un RNA de referencia exógena para PCR cuantitativa.
Abstract
Se describe un flujo de trabajo para el análisis de la expresión génica de las células endoteliales sometidos a un constante flujo laminar utilizando múltiples cámaras monitoreadas flujo de placas paralelas. Las células endoteliales forman el revestimiento celular interno de los vasos sanguíneos y están crónicamente expuestas a la fuerza de fricción del flujo de sangre llamado tensión de esquileo. En condiciones fisiológicas, la función de las células endoteliales en presencia de varias condiciones de esfuerzo cortante. Por lo tanto, la aplicación de las condiciones de tensión de esquileo en vitro modelos permiten comprender mejor una mayor respuesta endotelial in vivo. La cámara de placas paralelas flujo previamente publicada por Lane et al. 9 se adapta para estudiar la regulación de los genes endoteliales en presencia y ausencia de flujo laminar (no pulsátil) constante. Adaptaciones claves en la configuración para flujo laminar como se presenta aquí incluyen un entorno grande, dedicado a los circuitos de flujo concurrente de la casa, el control de caudales en tiempo real y la inclusión de una referencia exógena RNA para la normalización de datos cuantitativos de PCR en tiempo real. Para evaluar varias condiciones de tratamientos con la aplicación de la tensión de esquileo, múltiples circuitos de flujo y bombas se utilizan simultáneamente en la misma incubadora calentada y humidificada. El caudal de cada circuito de flujo se mide continuamente en tiempo real a estandarizar las condiciones de esfuerzo cortante a lo largo de los experimentos. Debido a estos experimentos tienen condiciones múltiples, también utilizamos un RNA de referencia exógena que se enriquecieron en el momento de la extracción de RNA para la normalización de la extracción de RNA y la eficiencia de síntesis de primera-strand cDNA. Estos pasos minimizan la variabilidad entre las muestras. Esta estrategia se emplea en nuestros proyectos para el análisis de expresión génica con tensión de esquileo experimentos usando la cámara de flujo paralelo de la placa, pero partes de esta estrategia, como la exógena de referencia punto de RNA, pueden fácilmente y rentable utilizadas para otras aplicaciones.
Introduction
Las células endoteliales vasculares forman la guarnición celular interna de los vasos sanguíneos en el sistema cardiovascular cerrado de especies mayores. Forman la interfaz entre la sangre y los tejidos y se caracterizan por luminal y abluminal superficies. El endotelio es un sistema diverso, activo y adaptativo que regula el flujo de sangre, trata de nutrientes, inmunidad y el crecimiento de los vasos de sangre nueva1. En el cuerpo, las células endoteliales existen normalmente en un entorno donde están expuestos a la fuerza friccional de la circulación, tensión de cizalla2. Tensión de esquileo es un importante regulador de la célula endotelial gene expression3y células endoteliales intentan mantener la tensión de esquileo dentro de un rango dado2,4. Las células endoteliales muestran angiogénicos patrones en ausencia de tensión de esquileo5 que puede mejorar la perfusión del tejido. Patrones regionales del flujo disturbado y tensión de esquileo alterado se asocia a la expresión de genes inflamatorios6 y el desarrollo de ateroesclerosis7,8. Así, modelos que incluyen la tensión de esquileo son un componente importante de la comprensión de la regulación de los genes endoteliales.
Se describe un método para el estudio de la regulación génica en las células endoteliales vasculares bajo tensión de esquileo. Este sistema utiliza flujo no pulsátil e imita los niveles de tensión de esquileo líquido y concentración de oxígeno condiciones de modelo para las células endoteliales arteriales. Este protocolo incluye los detalles de los métodos para la caída de genes mediante ARN de interferencia (ARNi), la configuración de la aplicación del esfuerzo cortante con el aparato de flujo de placas paralelas y métodos para la espiga de una referencia exógena RNA antes del análisis por reacción en cadena reversa-transcriptase de polimerasa cuantitativa (RT-qPCR). Esta tubería se utiliza para estudiar la regulación de los genes en las células endoteliales en presencia y en ausencia de tensión de esquileo laminar e incluye una adaptación de los aparatos de placas paralelas flujo descritos por Lane et al. 9. esta configuración particular fue diseñado para facilitar la evaluación simultánea de varias condiciones experimentales que permite la comparación directa de las condiciones de esfuerzo cortante, así como la normalización de análisis de ARN. Una gran unidad con humedad controlada se utiliza para permitir que múltiples cámaras de flujo separado y bombas que se ejecutan simultáneamente con tasas de flujo para cada montaje de la cámara de flujo en tiempo real. La aplicación de esta disposición se utiliza para la precipitación del gene mediante RNAi en el ajuste de la tensión de esquileo del flujo laminar /, pero los aspectos de este protocolo se pueden aplicar a cualquier evaluación de la expresión de RNA.
Métodos comunes para la aplicación de la tensión de esquileo para células endoteliales incluyen sistemas de microfluidos10, un viscosímetro de cono y placa11y una cámara de placas paralelas flujo12. Sistemas microfluídicos de diversos fabricantes han sido útiles en el estudio de la mecanobiología y mecanotransducción en múltiples células y tipos de tejidos y una variedad de estímulos biofísicos. Para las células endoteliales, se han utilizado para el estudio de las células endoteliales en aislamiento, así como la interacción de las células endoteliales y el tráfico de células de inmune o tumor10. Sin embargo, estos sistemas son menos convenientes para la recuperación de grandes cantidades de células9. El Viscosímetro de cono y plato y cámaras de placas paralelas de flujo permiten la recuperación de un gran número de células en monocapas confluentes12. Estos sistemas pueden generar una variedad de esquileo las fuerzas y patrones de12. Las placas paralelas flujo cámara Asamblea9 tiene la ventaja de que imagen en tiempo real puede realizarse a través de la ventana de cristal para evaluar la morfología celular en cualquier momento. Además, se puede recoger la solución en condiciones estériles. Para el sistema presentado aquí, el flujo también puede ser monitoreado en tiempo real y en un montaje multicámara, que facilita el mantenimiento de condiciones de cizalla entre las cámaras.
Experimentos representativos, se utilizan células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), que representan un tipo de célula endotelial macrovasculares, y las condiciones de esfuerzo cortante que utilizamos (1 Pa) reflejan las condiciones arteriales (0.1 – 0.7 Pa). Sin embargo, este protocolo se puede utilizar con otros tipos de células endoteliales, y las condiciones de tensión de esquileo se pueden ajustar según la pregunta experimental. Por ejemplo, la evaluación de células endoteliales humanas en condiciones de circulación venosa del modelo requiere bajos niveles de tensión de esquileo (1-6 Pa) y estudios que modelan la circulación microvascular han utilizado niveles de tensión de esquileo de 0.4 – 1.2 Pa13 , 14. Además, la tensión de esquileo puede variar incluso entre las células endoteliales en el mismo vaso sanguíneo6. En la configuración actual, se utiliza un único sistema de vigilancia que puede monitorear simultáneamente cuatro bucles de flujo separado. Para los laboratorios que necesitan más lazos de flujo, hay espacio en el ambiente dedicado para un sistema de monitoreo adicional.
RT-qPCR se utiliza para la cuantificación absoluta de la expresión génica en el ajuste de tensión de esquileo. La expresión relativa de genes de la blanco a menudo se utiliza para comparar la expresión de RNA en condiciones. Algunas especies de RNA pueden existir en cantidades muy bajas o estar ausente, complicando así mediciones relativas. Por ejemplo, larga noncoding RNAs en las células endoteliales pueden ejercer un efecto potente en números relativamente bajos copia por célula5. Además, las diferencias en la eficiencia de la cartilla pueden conducir a una interpretación inexacta de utilizando el método de delta-delta ciclo umbral (Ct) para analizar los datos. Para abordar esta preocupación, realizamos la cuantificación absoluta mediante la generación de una curva estándar utilizando una cantidad conocida de ADN plásmido. Además, síntesis complementaria de DNA (cDNA) es un proceso ineficiente, y diferencias en la eficiencia de cDNA pueden explicar las diferencias en la expresión de RNA entre condiciones y entre las muestras15. La aplicación de la tensión de esquileo o reactivos de transfección puede afectar viabilidad, apoptosis y proliferación celular, o agregar componentes que puedan interferir con la síntesis de ARN aislamiento o cDNA. Para tener en cuenta la posibilidad de sesgo de aislamiento de RNA y síntesis de cDNA, utilizamos un spike en control de RNA sintetizado en el laboratorio, añadido en el momento de la extracción de RNA y medidos con cada cDNA síntesis mediante RT-qPCR. Esto permite no sólo el ajuste técnico las diferencias en la extracción y cDNA síntesis de RNA pero también permite el cálculo de cantidades absolutas por la célula, cuando se conoce el conteo de células.
Este sistema utiliza medidas adicionales para mantener la similitud o cuenta las diferencias técnicas entre las condiciones. Particularmente enfatizamos estos pasos debido a la naturaleza compleja de estos experimentos, que implican múltiples configuraciones físicas y condiciones experimentales que pueden conducir a la variabilidad experimental.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tensión de esquileo es una condición fisiológica que modula la función endotelial, en parte, mediante la expresión de gene de estado estacionario2,5. Modelos de regulación génica en varias condiciones de esfuerzo cortante contribuirá a una mayor comprensión de la función endotelial. Este flujo de trabajo pragmático incluye un circuito de flujo usando una cámara de flujo paralelo de la placa de Lane et al. 9 y represent…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por CIHR fregona 142307 a p.a.m. H.S.J.M. es un beneficiario de un programa canadiense de institutos de salud investigación formación en beca de medicina regenerativa. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. y M.K.D. son los destinatarios de las becas de postgrado Reina Elizabeth II en la ciencia y la tecnología.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | gibco | 25300-062 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 10 mm2 Culture Dish | Sarstedt | 83.3902 | |
| 30 mL Syringe | BD | 302832 | |
| 4-Way Stopcocks | Discofix | D500 | |
| Aluminum foil | |||
| BEACH | Darwin Chambers Company | MN: HO85, SN: 4947549 | |
| Cell Scrapers | |||
| CO2 Meter | BioSphenix, Ltd. | MN: P120, SN: 0342 | |
| CO2 Sensor | BioSphenix, Ltd. | MN: C700, SN: 52852 | |
| Distilled water | gibco | 15230-170 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) -/- | gibco | 14190-144 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | Promo Cell | C-22011 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix | Promo Cell | C-39216 | |
| Fibronectin (pure) | Sigma-Aldrich | 11051407001 | |
| Filter (0.20 um) | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Flow Dampener and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Meter: 400 Series Console | Transonic Scisense Inc. | T402 | |
| Flow Meter: 400 Series Tubing | Transonic Scisense Inc. | TS410 | |
| Flow Reservoir and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Sensor | Transonic Scisense Inc. | ME4PXL | |
| Isotemp 737F Oven | Fisher Scientific | FI-737F | |
| J cloth | J cloth | ||
| Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm) | Fisherfinest | 12-544-4 | |
| Paper sterilization pouch | Cardinal Health | 92713 | |
| Pump (Masterflex L/S Economy Drive) | Cole-Parmer | 7554-90 | |
| Pump Head (Masterflex L/S Easy Load) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| Rectangular 4 Well Dish | Thermo Scientific | 267061 | |
| Tweezers | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tubing | |||
| Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-25 | |
| Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-14 | |
| Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-16 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-13 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-14 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luer | |||
| 3/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-08 | For #25 tubing |
| 1/8" Male Luer | Cole-Parmer | 30800-24 | For #16 tubing |
| 1/8" Female Luer | Cole-Parmer | 30800-08 | For #16 tubing |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-00 | For #14 tubing |
| 1/16" Female Luer | Cole-Parmer | 45508-00 | For #14 tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockdown reagents | |||
| Oligofectamine Reagent | Invitrogen | 12252-011 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | gibco | 31985-070 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In vitro transcription | |||
| Generuler 1kb+ DNA ladder | Thermo Scientific | SM1331 | |
| MEGAclear Kit | Ambion | AM1908 | |
| mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| pSP-luc+ | Promega | E4471 | |
| Supercoiled DNA Ladder | New England BioLabs Inc. | N0472S | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| UltraPure Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585011 | |
| XhoI Restriction Enzyme | New England BioLabs Inc. | R0146S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction | |||
| Beta-mercaptoethanol | Sigma | M3148-100mL | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
References
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