إعداد شرائح الحبل الشوكي الحاد لتسجيل كامل الخلية التصحيح-المشبك في الخلايا العصبية جيلاتينوسا الدماغ
Summary
هنا، نحن تصف الخطوات الأساسية لتسجيلات المشبك تصحيح كامل الخلية من الخلايا العصبية في الدماغ جيلاتينوسا (سان جرمان) في شريحة الحبل الشوكي في المختبر . يسمح هذا الأسلوب خصائص الغشاء الجوهرية وانتقال متشابك وتوصيف الخصائص المورفولوجية سان جرمان الخلايا العصبية دراستها.
Abstract
وقدمت دراسات أجريت مؤخرا المشبك تصحيح كامل الخلية من الخلايا العصبية في الدماغ جيلاتينوسا (سان جرمان) مجموعة كبيرة من المعلومات عن آليات العمود الفقري الكامنة وراء انتقال الحسية والتنظيم nociceptive، وتنمية ألم أو حكة مزمنة. كذلك تحسنت تطبيقات التسجيلات الكهربية إلى جانب الدراسات المورفولوجية استناداً إلى الأداة المساعدة لشرائح الحبل الشوكي الحاد لفهمنا لخصائص الخلايا العصبية وتكوين الدوائر المحلية في سان جرمان. وهنا، نقدم دليل المفصل وعملية لإعداد شرائح الحبل الشوكي وإظهار الممثل كامل الخلية التسجيل والنتائج المورفولوجية. هذا البروتوكول يسمح بالمحافظة على الخلايا العصبية مثالية، ويمكن أن تحاكي في فيفو الظروف إلى حد ما. وباختصار، القدرة على الحصول على التحضير في المختبر لشرائح الحبل الشوكي تمكن تسجيلات المشبك الحالية والجهد مستقرة ويمكن وبالتالي تسهيل تحقيقات مفصلة في خصائص الغشاء الجوهرية، الدوائر المحلية و هيكل الخلايا العصبية باستخدام مختلف النهج التجريبي.
Introduction
جيلاتينوسا المادة (سان جرمان، الصفيحة الثاني من القرن الأفريقي الظهرية العمود الفقري) مركز ترحيل هام بلا منازع ليحيل بها وتنظيم المعلومات الحسية. وهو يتألف من إينتيرنيورونس عليه والمثبطة، التي تتلقى مدخلات من الألياف الزبائ الأولية، إينتيرنيورونس المحلية، و نظام المثبطة تنازلي الذاتية1. في العقود الأخيرة، ومكنت تطوير إعداد شريحة الحبل الشوكي الحاد وظهور تسجيل كامل الخلية التصحيح-المشبك دراسات مختلفة عن الخصائص الجوهرية الكهربية والمورفولوجية ل الخلايا العصبية SG2، 3 , 4 فضلا عن دراسات للدوائر المحلية في سان جرمان5،6. وباﻹضافة إلى ذلك، باستخدام إعداد شريحة الحبل الشوكي في المختبر ، الباحثين ويمكن تفسير التغييرات في الخلايا العصبية اكسسيتابيليتيس7،8، وظيفة أيون القنوات10من9،، و أنشطة متشابك11،12 تحت مختلف الظروف المرضية. وقد تعمقت هذه الدراسات فهمنا للدور الذي تؤديه سان جرمان الخلايا العصبية في تطوير وصيانة الألم المزمن وحكة الأعصاب.
أساسا، الشرط الأساسي لتحقيق وضع تصور واضح سوما الخلايا العصبية والمثالي كامل الخلية التصحيح باستخدام شرائح الحبل الشوكي الحاد لضمان نوعية ممتازة من شرائح حتى يمكن الحصول على الخلايا العصبية سليمة وباتشابل. ومع ذلك، إعداد شرائح الحبل الشوكي ينطوي على عدة خطوات، مثل القيام الاستئصال البطني وإزالة غشاء العنكبوتية بيا، الذي قد تكون عقبات في الحصول على شرائح صحية. على الرغم من أنه ليس من السهل إعداد شرائح الحبل الشوكي، أداء التسجيلات في المختبر على شرائح الحبل الشوكي مزايا عدة. بالمقارنة مع خلية ثقافة الأعمال التحضيرية، شرائح الحبل الشوكي يمكن جزئيا الحفاظ على اتصالات متشابك المتأصلة التي في حالة فسيولوجيا ذات صلة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الجمع بين كامل الخلية التصحيح-المشبك تسجيل باستخدام شرائح الحبل الشوكي مع أساليب أخرى، مثل التصحيح مزدوجة المشبك13،14و15،الدراسات المورفولوجية16 وخليه واحدة RT-PCR 17-ولذلك، هذا الأسلوب يوفر المزيد من المعلومات في وصف الاختلافات التشريحية والوراثية داخل منطقة محددة ويسمح للتحقيق في تشكيل الدوائر المحلية.
هنا، نحن نقدم وصفاً الأساسية والتفصيلية لأسلوبنا لإعداد شرائح الحبل الشوكي الحاد والحصول على تسجيلات المشبك تصحيح كامل الخلية من الخلايا العصبية SG.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول تفاصيل الخطوات اللازمة لإعداد شرائح الحبل الشوكي، التي كنا قد استخدمت بنجاح عند إجراء تجارب كامل الخلية التصحيح-المشبك في سان جرمان الخلايا العصبية18،19،،من2021. من خلال تنفيذ هذا الأسلوب، ونحن ذكرت مؤخرا …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل المنح المقدمة من “مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية” (رقم 81560198، 31660289).
Materials
| NaCl | Sigma | S7653 | Used for the preparation of ACSF and PBS |
| KCl | Sigma | 60130 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution |
| NaH2PO4·2H2O | Sigma | 71500 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| MgCl2·6H2O | Sigma | M2670 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| D-Glucose | Sigma | G7021 | Used for the preparation of ACSF |
| Ascorbic acid | Sigma | P5280 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sodium pyruvate | Sigma | A7631 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sucrose | Sigma | S7903 | Used for the preparation of sucrose-ACSF |
| K-gluconate | Wako | 169-11835 | Used for the preparation of K+-based intracellular solution |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P1937 | Used for the preparation of intracellular solution |
| EGTA | Sigma | E3889 | Used for the preparation of intracellular solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | Used for the preparation of intracellular solution |
| CsMeSO4 | Sigma | C1426 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| CsCl | Sigma | C3011 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| TEA-Cl | Sigma | T2265 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| Neurobiotin 488 | Vector | SP-1145 | 0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies |
| Agar | Sigma | A7002 | 3% agar block was used in our protocol |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing |
| Na2HPO4 | Hengxing Chemical Reagents | Used for the preparation of PBS | |
| Mount Coverslipping Medium | Polyscience | 18606 | |
| Urethan | National Institute for Food and Drug Control | 30191228 | 1.5 g/kg, i.p. |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | 1.5 mm OD, 1.12 mm ID |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Used for the preparation of micropipettes |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Vibration isolation table | Technical Manufacturing Corporation | 63544 | |
| Infrared CCD camera | Dage-MIT | IR-1000 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| X-Y stage | Burleigh | GIBRALTAR X-Y | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| PH meter | Mettler Toledo | FE20 | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM 700 |
References
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
- Yoshimura, M., Nishi, S. Blind patch-clamp recordings from substantia gelatinosa neurons in adult rat spinal cord slices: pharmacological properties of synaptic currents. 신경과학. 53 (2), 519-526 (1993).
- Maxwell, D. J., Belle, M. D., Cheunsuang, O., Stewart, A., Morris, R. Morphology of inhibitory and excitatory interneurons in superficial laminae of the rat dorsal horn. The Journal of Physiology. 584 (Pt. 2, 521-533 (2007).
- Grudt, T. J., Perl, E. R. Correlations between neuronal morphology and electrophysiological features in the rodent superficial dorsal horn. The Journal of Physiology. 540 (Pt 1), 189-207 (2002).
- Lu, Y., et al. A feed-forward spinal cord glycinergic neural circuit gates mechanical allodynia. Journal of Clinical Investigation. 123 (9), 4050-4062 (2013).
- Zheng, J., Lu, Y., Perl, E. R. Inhibitory neurones of the spinal substantia gelatinosa mediate interaction of signals from primary afferents. The Journal of Physiology. 588 (Pt 12), 2065-2075 (2010).
- Balasubramanyan, S., Stemkowski, P. L., Stebbing, M. J., Smith, P. A. Sciatic chronic constriction injury produces cell-type-specific changes in the electrophysiological properties of rat substantia gelatinosa neurons. Journal of Neurophysiology. 96 (2), 579-590 (2006).
- Zhang, L., et al. Extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation is required for itch sensation in the spinal cord. Molecular Brain. 7, 25 (2014).
- Kopach, O., et al. Inflammation alters trafficking of extrasynaptic AMPA receptors in tonically firing lamina II neurons of the rat spinal dorsal horn. Pain. 152 (4), 912-923 (2011).
- Takasu, K., Ono, H., Tanabe, M. Spinal hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channels at primary afferent terminals contribute to chronic pain. Pain. 151 (1), 87-96 (2010).
- Iura, A., Takahashi, A., Hakata, S., Mashimo, T., Fujino, Y. Reductions in tonic GABAergic current in substantia gelatinosa neurons and GABAA receptor delta subunit expression after chronic constriction injury of the sciatic nerve in mice. European Journal of Pain. 20 (10), 1678-1688 (2016).
- Alles, S. R., et al. Peripheral nerve injury increases contribution of L-type calcium channels to synaptic transmission in spinal lamina II: Role of alpha2delta-1 subunits. Molecular Pain. 14, 1-12 (2018).
- Santos, S. F., Rebelo, S., Derkach, V. A., Safronov, B. V. Excitatory interneurons dominate sensory processing in the spinal substantia gelatinosa of rat. The Journal of Physiology. 581 (Pt 1), 241-254 (2007).
- Lu, Y., Perl, E. R. Modular organization of excitatory circuits between neurons of the spinal superficial dorsal horn (laminae I and II). The Journal of Neuroscience. 25 (15), 3900-3907 (2005).
- Hantman, A. W., van den Pol, A. N., Perl, E. R. Morphological and physiological features of a set of spinal substantia gelatinosa neurons defined by green fluorescent protein expression. The Journal of Neuroscience. 24 (4), 836-842 (2004).
- Yasaka, T., Tiong, S. Y., Hughes, D. I., Riddell, J. S., Todd, A. J. Populations of inhibitory and excitatory interneurons in lamina II of the adult rat spinal dorsal horn revealed by a combined electrophysiological and anatomical approach. Pain. 151 (2), 475-488 (2010).
- Yin, H., Park, S. A., Han, S. K., Park, S. J. Effects of 5-hydroxytryptamine on substantia gelatinosa neurons of the trigeminal subnucleus caudalis in immature mice. Brain Research. 1368, 91-101 (2011).
- Hu, T., et al. Lidocaine Inhibits HCN Currents in Rat Spinal Substantia Gelatinosa Neurons. Anesthesia and Analgesia. 122 (4), 1048-1059 (2016).
- Peng, H. Z., Ma, L. X., Lv, M. H., Hu, T., Liu, T. Minocycline enhances inhibitory transmission to substantia gelatinosa neurons of the rat spinal dorsal horn. 신경과학. 319, 183-193 (2016).
- Peng, S. C., et al. Contribution of presynaptic HCN channels to excitatory inputs of spinal substantia gelatinosa neurons. 신경과학. 358, 146-157 (2017).
- Liu, N., Zhang, D., Zhu, M., Luo, S., Liu, T. Minocycline inhibits hyperpolarization-activated currents in rat substantia gelatinosa neurons. Neuropharmacology. 95, 110-120 (2015).
- Brown, T. H. Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats. Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. The Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).
- Rice, M. E. Use of ascorbate in the preparation and maintenance of brain slices. Methods. 18 (2), 144-149 (1999).
- Takasu, K., Ogawa, K., Minami, K., Shinohara, S., Kato, A. Injury-specific functional alteration of N-type voltage-gated calcium channels in synaptic transmission of primary afferent C-fibers in the rat spinal superficial dorsal horn. European Journal of Pharmacology. 772, 11-21 (2016).
- Tian, L., et al. Excitatory synaptic transmission in the spinal substantia gelatinosa is under an inhibitory tone of endogenous adenosine. Neuroscience Letters. 477 (1), 28-32 (2010).
- Funai, Y., et al. Systemic dexmedetomidine augments inhibitory synaptic transmission in the superficial dorsal horn through activation of descending noradrenergic control: an in vivo patch-clamp analysis of analgesic mechanisms. Pain. 155 (3), 617-628 (2014).
- Yamasaki, H., Funai, Y., Funao, T., Mori, T., Nishikawa, K. Effects of tramadol on substantia gelatinosa neurons in the rat spinal cord: an in vivo patch-clamp analysis. PLoS One. 10 (5), e0125147 (2015).
- Furue, H., Narikawa, K., Kumamoto, E., Yoshimura, M. Responsiveness of rat substantia gelatinosa neurones to mechanical but not thermal stimuli revealed by in vivo patch-clamp recording. The Journal of Physiology. 521 (Pt 2), 529-535 (1999).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visualized Experiments. (132), e53825 (2018).
- Li, J., Baccei, M. L. Neonatal Tissue Damage Promotes Spike Timing-Dependent Synaptic Long-Term Potentiation in Adult Spinal Projection Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (19), 5405-5416 (2016).
- Ford, N. C., Ren, D., Baccei, M. L. NALCN channels enhance the intrinsic excitability of spinal projection neurons. Pain. , (2018).
- Cui, L., et al. Modulation of synaptic transmission from primary afferents to spinal substantia gelatinosa neurons by group III mGluRs in GAD65-EGFP transgenic mice. Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1102-1111 (2011).
- Yang, K., Ma, R., Wang, Q., Jiang, P., Li, Y. Q. Optoactivation of parvalbumin neurons in the spinal dorsal horn evokes GABA release that is regulated by presynaptic GABAB receptors. Neuroscience Letters. , 55-59 (2015).
