यहाँ, हम पूरे सेल पैच के लिए आवश्यक कदम का वर्णन-substantia gelatinosa (एसजी) न्यूरॉन्स से निर्मित में इन विट्रो रीढ़ की हड्डी टुकड़ा से बना रिकॉर्डिंग दबाना. इस विधि आंतरिक झिल्ली गुण, synaptic संचरण और एसजी न्यूरॉन्स के रूपात्मक लक्षण वर्णन की अनुमति देता है अध्ययन किया जाना है ।
हाल ही में पूरे सेल पैच-substantia gelatinosa (एसजी) न्यूरॉन्स से clamping अध्ययन रीढ़ की हड्डी में अंतर्निहित के बारे में जानकारी का एक बड़ा शरीर प्रदान की है संवेदी संचरण, nociceptive विनियमन, और पुराने दर्द या खुजली विकास । electrophysiological रिकॉर्डिंग के कार्यांवयन तीव्र रीढ़ की हड्डी की उपयोगिता के आधार पर रूपात्मक अध्ययन के साथ एक साथ और अधिक ंयूरॉन गुण और एसजी में स्थानीय सर्किट की संरचना के बारे में हमारी समझ में सुधार हुआ है । यहां, हम रीढ़ की हड्डी स्लाइस और शो प्रतिनिधि पूरे सेल रिकॉर्डिंग और रूपात्मक परिणाम की तैयारी के लिए एक विस्तृत और व्यावहारिक गाइड प्रस्तुत करते हैं । इस प्रोटोकॉल आदर्श ंयूरॉन संरक्षण परमिट और vivo परिस्थितियों में एक निश्चित सीमा तक नकल कर सकते हैं । संक्षेप में, करने के लिए एक इन विट्रो में रीढ़ की हड्डी के स्लाइस की तैयारी को प्राप्त करने की क्षमता स्थिर वर्तमान और वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग सक्षम बनाता है और इस प्रकार आंतरिक झिल्ली संपत्तियों में विस्तृत जांच की सुविधा सकता है, स्थानीय सर्किट और विविध प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का उपयोग कर ंयूरॉन संरचना ।
substantia gelatinosa (एसजी, लेमिना रीढ़ की हड्डी पृष्ठीय सींग के द्वितीय) एक निर्विवाद रूप से महत्वपूर्ण प्रसारण और संवेदी सूचना विनियमन के लिए रिले केंद्र है । यह उत्तेजक और निरोधात्मक न्यूरॉन्स से बना है, जो प्राथमिक afferent फाइबर, स्थानीय न्यूरॉन्स, और अंतर्जात उतरते निरोधात्मक प्रणाली1से आदानों प्राप्त करते हैं. हाल के दशकों में, तीव्र रीढ़ की हड्डी टुकड़ा तैयारी के विकास और पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग के आगमन के आंतरिक electrophysiological और रूपात्मक गुण पर विभिंन अध्ययनों एसजी ंयूरॉंस2सक्षम है, 3 , 4 एसजी5,6में स्थानीय सर्किट के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अध्ययन । इसके अलावा, इन विट्रो में रीढ़ की हड्डी टुकड़ा तैयारी का उपयोग करके, शोधकर्ताओं ने न्यूरॉन excitabilities में परिवर्तन की व्याख्या कर सकते हैं7,8, आयन चैनल के समारोह9,10, और synaptic गतिविधियों11,12 विभिन्न रोग की स्थिति के अंतर्गत । इन अध्ययनों की भूमिका की हमारी समझ गहरा है कि एसजी ंयूरॉंस के विकास और पुराने दर्द और neuropathic खुजली के रखरखाव में खेलते हैं ।
अनिवार्य रूप से, कुंजी शर्त के लिए एक स्पष्ट दृश्य प्राप्त करने के लिए ंयूरॉन सोमा और आदर्श पूरे-कोशिका पैचिंग तीव्र रीढ़ की हड्डी के स्लाइस का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए उत्कृष्ट गुणवत्ता के स्लाइस इतना स्वस्थ और patched ंयूरॉंस प्राप्त किया जा सकता है । हालांकि, रीढ़ की हड्डी के स्लाइस की तैयारी एक ventral laminectomy प्रदर्शन और पिया-रेशेदार झिल्ली, जो स्वस्थ स्लाइस प्राप्त करने में बाधा हो सकती है हटाने के रूप में कई कदम, शामिल है । हालांकि यह रीढ़ की हड्डी स्लाइस तैयार करने के लिए आसान नहीं है, रीढ़ की हड्डी के स्लाइस पर इन विट्रो में रिकॉर्डिंग प्रदर्शन कई फायदे हैं । सेल संस्कृति की तैयारी की तुलना में, रीढ़ की हड्डी स्लाइस आंशिक रूप से अंतर्निहित synaptic कनेक्शन है कि एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक हालत में है संरक्षित कर सकते हैं । इसके अलावा, पूरे सेल पैच-दबाना रीढ़ की हड्डी स्लाइस का उपयोग कर रिकॉर्डिंग ऐसे डबल पैच क्लैंप के रूप में अन्य तकनीकों के साथ जोड़ा जा सकता है13,14, रूपात्मक अध्ययन15,16 और एकल सेल आरटी-पीसीआर 17. इसलिए, इस तकनीक को एक विशिष्ट क्षेत्र के भीतर संरचनात्मक और आनुवंशिक विचलन निस्र्पक पर अधिक जानकारी प्रदान करता है और स्थानीय सर्किट की संरचना की जांच के लिए अनुमति देता है ।
यहां, हम तीव्र रीढ़ की हड्डी के स्लाइस तैयार करने और एसजी न्यूरॉन्स से पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए हमारे विधि का एक बुनियादी और विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं ।
यह प्रोटोकॉल स्पाइनल कॉर्ड स्लाइस तैयार करने के लिए चरण विवरण, जो हमने सफलतापूर्वक उपयोग किया है जब पूरे-सेल पैच-क्लैंप प्रयोगों पर एसजी न्यूरॉन्स18,19,20,21…
The authors have nothing to disclose.
यह काम चीन की राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (No. ८१५६०१९८, ३१६६०२८९) से अनुदान द्वारा समर्थित था ।
NaCl | Sigma | S7653 | Used for the preparation of ACSF and PBS |
KCl | Sigma | 60130 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution |
NaH2PO4·2H2O | Sigma | 71500 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS |
CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
MgCl2·6H2O | Sigma | M2670 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
D-Glucose | Sigma | G7021 | Used for the preparation of ACSF |
Ascorbic acid | Sigma | P5280 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
Sodium pyruvate | Sigma | A7631 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
Sucrose | Sigma | S7903 | Used for the preparation of sucrose-ACSF |
K-gluconate | Wako | 169-11835 | Used for the preparation of K+-based intracellular solution |
Na2-Phosphocreatine | Sigma | P1937 | Used for the preparation of intracellular solution |
EGTA | Sigma | E3889 | Used for the preparation of intracellular solution |
HEPES | Sigma | H4034 | Used for the preparation of intracellular solution |
Mg-ATP | Sigma | A9187 | Used for the preparation of intracellular solution |
Li-GTP | Sigma | G5884 | Used for the preparation of intracellular solution |
CsMeSO4 | Sigma | C1426 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
CsCl | Sigma | C3011 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
TEA-Cl | Sigma | T2265 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
Neurobiotin 488 | Vector | SP-1145 | 0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies |
Agar | Sigma | A7002 | 3% agar block was used in our protocol |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing |
Na2HPO4 | Hengxing Chemical Reagents | Used for the preparation of PBS | |
Mount Coverslipping Medium | Polyscience | 18606 | |
Urethan | National Institute for Food and Drug Control | 30191228 | 1.5 g/kg, i.p. |
Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | 1.5 mm OD, 1.12 mm ID |
Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Used for the preparation of micropipettes |
Vibratome | Leica | VT1000S | |
Vibration isolation table | Technical Manufacturing Corporation | 63544 | |
Infrared CCD camera | Dage-MIT | IR-1000 | |
Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
X-Y stage | Burleigh | GIBRALTAR X-Y | |
Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
PH meter | Mettler Toledo | FE20 | |
Confocol microscope | Zeiss | LSM 700 |