膠様質ニューロンの細胞パッチク ランプ記録のため急性脊髄スライスの準備
Summary
ここでは、脊髄スライス培養における膠 (SG) ニューロンから作られた全細胞パッチク録音のために不可欠な手順について述べる。このメソッドでは、組み込みの膜特性、シナプス伝達、調査される SG ニューロンの形態的特性をことができます。
Abstract
膠 (SG) ニューロンからの最近の全細胞パッチク ランプ-研究は、膨大な感覚伝達、侵害受容規制と慢性的な痛みやかゆみの開発の基礎となる脊髄のメカニズムについての情報を提供しています。急性脊髄スライスの効用に基づく形態学的研究と電気生理学的記録の実装は、神経膜特性の理解と SG の局所回路の構成にさらに改善しています。脊髄スライスとショー代表全細胞記録の形態の調製のための詳しく、実用的なガイドを紹介します。このプロトコルは、理想的な神経の保存を許可し、生体内である程度条件を模倣することができます。要約すると、脊髄スライス培養準備を取得できる安定した電流、電圧クランプ録音を有効にしたがって局所神経回路の組み込み膜プロパティに詳細な調査を促進する可能性があり、様々 な実験的アプローチによる神経の構造。
Introduction
膠 (SG、ラミナの脊髄後角 II) は送信および感覚情報を規制する議論の余地なく重要な中継センターです。一次求心性線維、ローカル介在ニューロンと内因性下行抑制系1から入力を受ける興奮性と抑制性の介在ニューロン、それで構成されます。最近十年間の急性脊髄スライス標本の開発と全細胞パッチク ランプ記録の出現 SG ニューロン2,の本質的な電気生理学的および形態学的特性の様々 な研究が可能にします。3,SG5,6の局所神経回路の研究と同様、 4 。また、体外脊髄スライス標本を使用して、研究者は、神経 excitabilities7,8の変化を解釈できる、9,10チャンネルはイオンの機能と各種病態下でシナプス活動11,12 。これらの研究は深めた SG ニューロンが開発に果たす役割の理解や慢性的な痛みや神経因性のかゆみのメンテナンスです。
基本的に、神経相馬や急性脊髄スライスを使用して理想的な全細胞パッチ適用の明確に可視化を達成するために重要な前提条件は、健康とパッチ適用可能な細胞を得ることができるので、スライスの優れた品質を確保するためです。しかし、脊髄スライスの準備と、腹側椎弓切除術を実行する、健康的なスライスの取得の障害となるクモ膜膜の削除など、いくつかの手順が含まれます。脊髄スライスを準備するは簡単じゃないがいくつかの利点があります脊髄スライス上の in vitro録音を実行します。細胞培養の準備と比較して、脊髄スライス部分的に関連する生理学的条件は、固有のシナプス接続を保持できます。さらに、脊髄スライスを使用して録音全細胞パッチクは二重パッチ クランプ13,14、形態学的研究15,16シングルセル RT-PCR 法などの他の手法と組み合わせることができます。17します。 したがって、この手法は、特定地域内で解剖学的および遺伝的多様性の特性に関する詳細と局所神経回路の構成の調査では。
ここでは、急性脊髄スライスの準備及び SG ニューロンから全体セル ホールセル記録手法の基本と詳細な説明を提供します。
Protocol
説明すべての実験のプロトコルは、動物倫理委員会の南昌大学 (南昌、PR 中国、倫理 No.2017-010) によって承認されました。すべての努力は、実験動物の苦痛やストレスを最小限に抑えるため行われました。ここで実行される電気生理学的記録は、常温 (RT、22-25 ° C) を実施しました。 1. 動物 どちらの性別の Sprague-dawley ラット (3-5 週齢) を使用します。12 時間の明暗?…
Representative Results
急性脊髄スライスは、図 1に示す図に従って調製しました。スライスと回復後、脊髄スライスは、記録室に移されました。健康的なニューロンは、IR DIC 顕微鏡を用いた相馬外観に基づいて識別されました。次に、SG ニューロンの活動電位が脱分極電流パルス (1 時間) のシリーズによって誘発されるときのニューロンは、RMP で開催されました。に…
Discussion
このプロトコルの詳細 SG ニューロン18,19,20,21の全細胞パッチク ランプ-実験を行う際、我々 は正常に使用している脊髄スライスを準備するための手順。このメソッドを実装すると、我々 は最近報告ミノサイクリン、テトラサイクリンの第二世代は著しく19SG ニューロンのシナプ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、中国の国家自然科学基金 (第 81560198、31660289) からの助成金によって支えられました。
Materials
| NaCl | Sigma | S7653 | Used for the preparation of ACSF and PBS |
| KCl | Sigma | 60130 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution |
| NaH2PO4·2H2O | Sigma | 71500 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| MgCl2·6H2O | Sigma | M2670 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| D-Glucose | Sigma | G7021 | Used for the preparation of ACSF |
| Ascorbic acid | Sigma | P5280 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sodium pyruvate | Sigma | A7631 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sucrose | Sigma | S7903 | Used for the preparation of sucrose-ACSF |
| K-gluconate | Wako | 169-11835 | Used for the preparation of K+-based intracellular solution |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P1937 | Used for the preparation of intracellular solution |
| EGTA | Sigma | E3889 | Used for the preparation of intracellular solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | Used for the preparation of intracellular solution |
| CsMeSO4 | Sigma | C1426 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| CsCl | Sigma | C3011 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| TEA-Cl | Sigma | T2265 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| Neurobiotin 488 | Vector | SP-1145 | 0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies |
| Agar | Sigma | A7002 | 3% agar block was used in our protocol |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing |
| Na2HPO4 | Hengxing Chemical Reagents | Used for the preparation of PBS | |
| Mount Coverslipping Medium | Polyscience | 18606 | |
| Urethan | National Institute for Food and Drug Control | 30191228 | 1.5 g/kg, i.p. |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | 1.5 mm OD, 1.12 mm ID |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Used for the preparation of micropipettes |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Vibration isolation table | Technical Manufacturing Corporation | 63544 | |
| Infrared CCD camera | Dage-MIT | IR-1000 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| X-Y stage | Burleigh | GIBRALTAR X-Y | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| PH meter | Mettler Toledo | FE20 | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM 700 |
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Tags
Acute Spinal Cord SlicesWhole-cell Patch-clamp RecordingSubstantia Gelatinosa NeuronsSensory TransmissionNociceptive RegulationChronic PainAgar BlockSucrose-based ACSFTranscardial PerfusionSpinal Cord ExtractionLumbosacral EnlargementMeninges RemovalPia Arachnoid MembraneVentral/dorsal RootsTransverse SlicesParasagittal SlicesVibratome
Cite This Article
Zhu, M., Zhang, D., Peng, S., Liu, N., Wu, J., Kuang, H., Liu, T. Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons. J. Vis. Exp. (143), e58479, doi:10.3791/58479 (2019).