Her beskriver vi de essential fremgangsmåte for hele celle patch-klemme opptak fra substantia gelatinosa (SG) nerveceller i ryggmargen sektoren i vitro . Denne metoden tillater indre membran egenskaper, synaptic overføring og morfologiske karakterisering av SG neurons å bli undersøkt.
Hele celle patch-klemme studier fra substantia gelatinosa (SG) neurons har gitt en stor mengde informasjon om spinal mekanismene bak sensoriske overføring, nociceptive regulering og kronisk smerte eller kløe utvikling. Implementeringer av elektrofysiologiske innspillinger sammen med morfologiske studier basert på nytten av akutt ryggmargen skiver har ytterligere forbedret vår forståelse av neuronal egenskaper og sammensetningen av lokale krets i SG. Her presenterer vi en detaljert og praktisk guide for utarbeidelse av ryggmargen skiver og Vis representant hele celle opptak og morfologiske resultater. Denne protokollen tillater ideelle neuronal bevaring og kanne etterligner i vivo forhold til en viss grad. I sammendraget, muligheten til å få en i vitro utarbeidelse av ryggmargen skiver gjør stabil strøm – og spenning-klemme innspillinger og kan dermed forenkle detaljerte undersøkelser i egenskapene indre membran, lokale krets og neuronal struktur bruke ulike eksperimentelle tilnærminger.
Substantia gelatinosa (SG, lamina II av spinal dorsal Hornet) er en udiskutabelt viktig relé for overføring og regulere sensoriske informasjonen. Det består av eksitatoriske og inhibitory interneurons, som mottar inndata fra primære afferente fiber, lokale interneurons og den endogene synkende hemmende system1. I de siste tiårene, har utvikling av akutt ryggmargen skive forberedelse og ankomsten av hele celle patch-klemme innspillingen aktivert ulike studier iboende elektrofysiologiske og morfologiske egenskaper SG neurons2, 3 , 4 samt studier av lokale kretsene i SG5,6. I tillegg bruker i vitro ryggmargen skive utarbeidelse, forskere kan tolke endringene i neuronal excitabilities7,8, funksjonen til ion kanaler9,10, og synaptiske aktiviteter11,12 under ulike patologiske forhold. Disse studiene har forsterket vår forståelse av rollen som SG neurons spille i utvikling og vedlikehold av kroniske smerter og nevropatisk kløe.
Hovedsak er den viktige forutsetningen for å oppnå en tydelig visualisering av neuronal soma og ideelle hele celle patching med akutt ryggmargen skiver å sikre den gode kvaliteten på skiver så sunn og patchable neurons kan oppnås. Imidlertid omfatter forbereder ryggmargen skiver flere tiltak, som utfører en ventrale laminectomy og fjerne pia-arachnoid membranen, som kan være hindringer å skaffe sunn skiver. Selv om det ikke er lett å forberede ryggmargen skiver, har utføre opptak i vitro på ryggmargen skiver flere fordeler. Sammenlignet med celle kultur forberedelser, kan ryggmarg skiver delvis bevare iboende synaptic tilkoblinger som er i en fysiologisk relevant forutsetning. I tillegg kan hele celle patch-klemme opptak med ryggmargen skiver kombineres med andre teknikker, for eksempel dobbel oppdateringen klemme13,14, morfologiske studier15,16 og encellede RT PCR 17. derfor denne teknikken gir mer informasjon om karakteriserer de anatomiske og genetiske forskjeller innenfor et bestemt område og gjør det mulig for undersøkelse av sammensetningen av lokale krets.
Her gir vi en grunnleggende og detaljert beskrivelse av vår metode for utarbeidelse akutt ryggmargen skiver og anskaffe hele celle patch-klemme opptak fra SG neurons.
Denne protokollen informasjon om fremgangsmåten for å forberede ryggmargen skiver, som vi har brukt med hell når hele celle patch-klemme eksperimenter på SG neurons18,19,20,21. Ved å implementere denne metoden, vi nylig rapportert at minocycline, en ny generasjon av tetracycline, kan kraftig forbedre hemmende synaptic overføring gjennom en presynaptic mekanisme i SG neurons<sup class="xre…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation av Kina (nr. 81560198, 31660289).
NaCl | Sigma | S7653 | Used for the preparation of ACSF and PBS |
KCl | Sigma | 60130 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution |
NaH2PO4·2H2O | Sigma | 71500 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS |
CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
MgCl2·6H2O | Sigma | M2670 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
D-Glucose | Sigma | G7021 | Used for the preparation of ACSF |
Ascorbic acid | Sigma | P5280 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
Sodium pyruvate | Sigma | A7631 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
Sucrose | Sigma | S7903 | Used for the preparation of sucrose-ACSF |
K-gluconate | Wako | 169-11835 | Used for the preparation of K+-based intracellular solution |
Na2-Phosphocreatine | Sigma | P1937 | Used for the preparation of intracellular solution |
EGTA | Sigma | E3889 | Used for the preparation of intracellular solution |
HEPES | Sigma | H4034 | Used for the preparation of intracellular solution |
Mg-ATP | Sigma | A9187 | Used for the preparation of intracellular solution |
Li-GTP | Sigma | G5884 | Used for the preparation of intracellular solution |
CsMeSO4 | Sigma | C1426 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
CsCl | Sigma | C3011 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
TEA-Cl | Sigma | T2265 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
Neurobiotin 488 | Vector | SP-1145 | 0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies |
Agar | Sigma | A7002 | 3% agar block was used in our protocol |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing |
Na2HPO4 | Hengxing Chemical Reagents | Used for the preparation of PBS | |
Mount Coverslipping Medium | Polyscience | 18606 | |
Urethan | National Institute for Food and Drug Control | 30191228 | 1.5 g/kg, i.p. |
Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | 1.5 mm OD, 1.12 mm ID |
Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Used for the preparation of micropipettes |
Vibratome | Leica | VT1000S | |
Vibration isolation table | Technical Manufacturing Corporation | 63544 | |
Infrared CCD camera | Dage-MIT | IR-1000 | |
Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
X-Y stage | Burleigh | GIBRALTAR X-Y | |
Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
PH meter | Mettler Toledo | FE20 | |
Confocol microscope | Zeiss | LSM 700 |