ויזואליזציה בזמן אמת וניתוח Chondrocyte לפציעה בגלל העמסה מכנית ב Explants הסחוס מאתר באופן מלא ללא פגע

Summary

אנו מציגים שיטה להערכת מידת המרחבי פציעה/מות תאים על המשטח במפרק של המפרקים מאתר ללא פגע לאחר היישום של המון מכני מבוקר או השפעות. בשיטה זו יכול לשמש כדי לחקור כיצד דלקת מפרקים ניוונית, גורמים גנטיים ו/או משטרי העמסה שונים משפיעים על פגיעות בחיי עיר chondrocytes.

Abstract

הומאוסטזיס של הסחוס במפרק תלוי הכדאיות של תושב תאים (chondrocytes). למרבה הצער, טראומה מכני יכול לגרום מוות chondrocyte נרחבת, שעלול כדי התמוטטות בלתי הפיכה של המפרק ואת תחילתה של דלקת מפרקים ניוונית. בנוסף, תחזוקה של הכדאיות chondrocyte חשוב בהליכים שתל osteochondral לקבלת תוצאות אופטימליות כירורגי. אנו מציגים שיטה להערכת מידת המרחבי פציעה/מות תאים על משטח שלם המפרקים synovial מאתר במפרק לאחר היישום של המון מכני מבוקר או השפעות. בשיטה זו ניתן להשתמש במחקרים השוואתיים כדי לחקור את ההשפעות של משטרי שונים העמסה מכנית, תנאים סביבתיים שונים או מניפולציות גנטיות, כמו גם בשלבים שונים של ניוון סחוס קצר – ו/או לטווח ארוך פגיעות של chondrocytes במפרק באתרו. המטרה של פרוטוקול הציג בכתב היד הוא להעריך את מידת פגיעה/מות תאים על המשטח במפרק של המפרקים synovial מאתר המרחבי. חשוב לציין, שיטה זו מאפשרת בדיקה על סחוס תקין לחלוטין מבלי להתפשר על תנאי גבול מקורית. יתר על כן, היא מאפשרת הדמיה בזמן אמת של chondrocytes במפרק המוכתם ביותר וניתוח יחיד המבוססת על תמונה של תא פגיעה הנגרמת על-ידי יישום של חשמל סטטי מבוקר ואת ההשפעה טעינת משטרי. התוצאות נציג שלנו להפגין כי בריא הסחוס explants, מידת פגיעה תא המרחבי תלוי ברגישות עוצמת הגודל וההשפעה עומס. השיטה שלנו ניתן להתאים בקלות לחקור את ההשפעות של משטרי שונים העמסה מכנית, תנאים סביבתיים שונים או מניפולציות גנטיות שונות על הפגיעות מכני של בחיי עיר chondrocytes במפרק.

Introduction

הסחוס במפרק (AC) הוא עומס הנושאת מרקמת מכסה ומגן עצמות המפרקים synovial, מתן חלקה היגוי משותפת. הומאוסטזיס רקמות תלויה הכדאיות של chondrocytes, סוג התא הבלעדית המתגוררים AC. עם זאת, חשיפה של הסחוס כוחות קיצוניים עקב טראומה (למשל, נופל, פציעות תאונה או ספורט רכב) או עקב אי-יציבות משותפת פוסט-טראומטי יכול לגרום מוות chondrocyte, המוביל אל התמוטטות בלתי הפיכה של המפרק (דלקת מפרקים ניוונית) ¹. יתר על כן, ב- osteochondral הרכבה הליכים שמטרתם לתקן פגמים המקומי סחוס פגום, ההכנסה-הקשורים לטראומה מכנית שתל מפחית את הכדאיות chondrocyte ויש לו השפעות מזיקות על תוצאות ניתוח².

סחוס explant מודלים משמשים כדי ללמוד את הרגישות של chondrocytes במפרק למוות תא מכנית-induced. מודלים אלה בדרך כלל להשתמש explants של חיות גדולות כדי לחקור את ההשפעות של טעינת תנאים, תנאי הסביבה וגורמים אחרים על התא פגיעות^{3,4,5,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15}. עם זאת, בשל גודלו של המפרקים מקורית, מודלים אלה דורשים בדרך כלל הסרת פקק מפני השטח במפרק של המפרק ללא פגע, ובכך להתפשר על תנאי גבול מקורית. יתר על כן, הם בדרך כלל דורשים יישום של המון מכני גדול כדי לגרום פגיעה בתא. לחלופין, סחוס מאתר explant מודלים מספקים מספר יתרונות על פני דגמים בעלי חיים גדולים בלימוד פגיעות מכניות בחיי עיר chondrocytes. בפרט, עקב שלהם בממדים קטנים יותר, מודלים אלה מאפשרים בדיקה של הסחוס במפרק ללא פגע באופן מלא מבלי לשנות את תקינות מקורית רקמות. בנוסף, הטעינה של הסחוס מאתר מתרחשת מעל אזורים קטנים קשר כזה chondrocyte מוות/פציעה יכולה להיגרם עם המון קטן (< 1 N). לבסוף, הגנום העכבר בקלות מטופל, הפיכת בדיקות הפגיעה גנים כמה ספציפית את הרגישות של chondrocytes בחיי עיר לפגיעה מכנית.

המטרה הכוללת של השיטה הציג כתב יד זה לכמת, באופן חזותי ב- real-זמן-המרחבי היקף באתרו בתוך תא מוות/פציעה עקב המון מכני שהוחלו על העכבר שלם מלא סחוס-על-עצם explants חוץ גופית בתוך. שיטה זו דורשת ניתוח זהיר של המפרקים synovial העכבר מבלי להתפשר על הכדאיות chondrocyte, ואחריו בדיקות מכניות של ויטראז’ים חיוני explants שימוש בהתקן רכוב מיקרוסקופ הדומה פלטפורמה בדיקות שפיתחנו לאחרונה כדי לכמת תכונות מכניות הסחוס מאתר¹⁶. במהלך בדיקות מכניות, חלק גדול של המשטח מפרקיות (שלם) של העצם והטרף הוא גלוי על מיקרוסקופ פלורסצנטיות יחיד, המאפשרים ניתוח מהירה של התא הכדאיות אחרי עומס מוחל. ניתוח דומה של תא שטח הכדאיות של הסחוס מאתר explants בוצעה בעבר, אך ללא יישום סימולטני של עומס¹⁷. יישומים אפשריים של השיטה שלנו כוללים מחקרים השוואתיים כדי לחקור את הפגיעות של chondrocytes במפרק כדי תנאים סביבתיים וגורמים מכאניים מבוקרים שונים, כמו גם הקרנת טיפולים שמטרתם להפחית את הרגישות של chondrocytes כדי העמסה מכנית.

Protocol

כל העבודה בעלי חיים אושרה על ידי הוועדה אוניברסיטת רוצ’סטר משאבים בעלי חיים. 1. פתרונות להכין תמיסת מלח מאוזנת של האנק (1 X HBSS) המכיל סידן, מגנזיום, אין פנול אדום. להתאים את ה-pH ל 7.4 על-ידי הוספת כמויות קטנות של HCl או NaOH. להתאים את osmolarity כדי 303 mOsm על-ידי הוספת NaCl או מים יוני…

Representative Results

שש שונה חלה פרוטוקולים טעינה (טעינה סטטית: 0.1 N, 0.5 N ו- 1 N 5 דקות; וטעינה ההשפעה: 1 mJ, 2 מ”ג ו 4 mJ) reproducibly המושרה לכימות תחומי תא פגיעת סחוס המפרק ואת הירך המתקבל 8-10-בת שבוע BALB/c עכברים (לשפות אחרות איור 2). חשוב, מידת פגיעה chondrocyte על פני השטח מפרקיות המרחבי נמדד במהירו?…

Discussion

השיטות המתוארות לעיל הועסקו בהצלחה להמחיש ובר קיימא נפגע/מת ב באתרו chondrocytes במפרק של המפרקים העכבר לאחר שנקבעו עומסים מכאניים או השפעות. בפרט, הצלחנו לנתח את הפגיעות מכני של chondrocytes בתוך הסחוס במפרק שלם מלא של שני המפרקים synovial שונים: מפרק הברך (דיסטלי עצמות הירך) ואת הכתף (humeri). התוצאות נ?…

Materials

Calcein, AM	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	C3100MP	20x50mg , Eugene, OR, USA
Propidium Iodide	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	P3566	1 mg/mL solution in water, 10mL, Eugene, OR, USA
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	276855	1L DMSO, anhydrous, ≥99.9%, St. Louis, MO, USA
HBSS (calcium, magnesium, no phenol red)	Gibco by Thermo Fisher Scientific	14025-092	1X, 500mL, Grand Island, NY, USA
Feather surgical blade (#11)	VWR	102097-822	Hatfield, PA, USA
Vapor pressure osmometer, VAPRO	ELITechGroup	Model 5520	Puteaux, France
pH meter	Beckman	Model Phi 32	Brea, CA, USA
Eppendorf thermomixer	Eppendorf AG	Model 5350	Hamburg, Germany
Motorized inverted research microscope	Olypmus	Model IX-81	Center Valley, PA, USA
Wooden applicator	Puritan Medical Products Company, LLC	807	6"x100, Guilford, ME, USA
1.5 Glass coverslips	Warner Instruments, LLC	64-1696	#1.5, 0.17mm thick, 40mm diameter, Hamden, CT, USA