אנו מציגים שיטה להערכת מידת המרחבי פציעה/מות תאים על המשטח במפרק של המפרקים מאתר ללא פגע לאחר היישום של המון מכני מבוקר או השפעות. בשיטה זו יכול לשמש כדי לחקור כיצד דלקת מפרקים ניוונית, גורמים גנטיים ו/או משטרי העמסה שונים משפיעים על פגיעות בחיי עיר chondrocytes.
הומאוסטזיס של הסחוס במפרק תלוי הכדאיות של תושב תאים (chondrocytes). למרבה הצער, טראומה מכני יכול לגרום מוות chondrocyte נרחבת, שעלול כדי התמוטטות בלתי הפיכה של המפרק ואת תחילתה של דלקת מפרקים ניוונית. בנוסף, תחזוקה של הכדאיות chondrocyte חשוב בהליכים שתל osteochondral לקבלת תוצאות אופטימליות כירורגי. אנו מציגים שיטה להערכת מידת המרחבי פציעה/מות תאים על משטח שלם המפרקים synovial מאתר במפרק לאחר היישום של המון מכני מבוקר או השפעות. בשיטה זו ניתן להשתמש במחקרים השוואתיים כדי לחקור את ההשפעות של משטרי שונים העמסה מכנית, תנאים סביבתיים שונים או מניפולציות גנטיות, כמו גם בשלבים שונים של ניוון סחוס קצר – ו/או לטווח ארוך פגיעות של chondrocytes במפרק באתרו. המטרה של פרוטוקול הציג בכתב היד הוא להעריך את מידת פגיעה/מות תאים על המשטח במפרק של המפרקים synovial מאתר המרחבי. חשוב לציין, שיטה זו מאפשרת בדיקה על סחוס תקין לחלוטין מבלי להתפשר על תנאי גבול מקורית. יתר על כן, היא מאפשרת הדמיה בזמן אמת של chondrocytes במפרק המוכתם ביותר וניתוח יחיד המבוססת על תמונה של תא פגיעה הנגרמת על-ידי יישום של חשמל סטטי מבוקר ואת ההשפעה טעינת משטרי. התוצאות נציג שלנו להפגין כי בריא הסחוס explants, מידת פגיעה תא המרחבי תלוי ברגישות עוצמת הגודל וההשפעה עומס. השיטה שלנו ניתן להתאים בקלות לחקור את ההשפעות של משטרי שונים העמסה מכנית, תנאים סביבתיים שונים או מניפולציות גנטיות שונות על הפגיעות מכני של בחיי עיר chondrocytes במפרק.
הסחוס במפרק (AC) הוא עומס הנושאת מרקמת מכסה ומגן עצמות המפרקים synovial, מתן חלקה היגוי משותפת. הומאוסטזיס רקמות תלויה הכדאיות של chondrocytes, סוג התא הבלעדית המתגוררים AC. עם זאת, חשיפה של הסחוס כוחות קיצוניים עקב טראומה (למשל, נופל, פציעות תאונה או ספורט רכב) או עקב אי-יציבות משותפת פוסט-טראומטי יכול לגרום מוות chondrocyte, המוביל אל התמוטטות בלתי הפיכה של המפרק (דלקת מפרקים ניוונית) 1. יתר על כן, ב- osteochondral הרכבה הליכים שמטרתם לתקן פגמים המקומי סחוס פגום, ההכנסה-הקשורים לטראומה מכנית שתל מפחית את הכדאיות chondrocyte ויש לו השפעות מזיקות על תוצאות ניתוח2.
סחוס explant מודלים משמשים כדי ללמוד את הרגישות של chondrocytes במפרק למוות תא מכנית-induced. מודלים אלה בדרך כלל להשתמש explants של חיות גדולות כדי לחקור את ההשפעות של טעינת תנאים, תנאי הסביבה וגורמים אחרים על התא פגיעות3,4,5,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15. עם זאת, בשל גודלו של המפרקים מקורית, מודלים אלה דורשים בדרך כלל הסרת פקק מפני השטח במפרק של המפרק ללא פגע, ובכך להתפשר על תנאי גבול מקורית. יתר על כן, הם בדרך כלל דורשים יישום של המון מכני גדול כדי לגרום פגיעה בתא. לחלופין, סחוס מאתר explant מודלים מספקים מספר יתרונות על פני דגמים בעלי חיים גדולים בלימוד פגיעות מכניות בחיי עיר chondrocytes. בפרט, עקב שלהם בממדים קטנים יותר, מודלים אלה מאפשרים בדיקה של הסחוס במפרק ללא פגע באופן מלא מבלי לשנות את תקינות מקורית רקמות. בנוסף, הטעינה של הסחוס מאתר מתרחשת מעל אזורים קטנים קשר כזה chondrocyte מוות/פציעה יכולה להיגרם עם המון קטן (< 1 N). לבסוף, הגנום העכבר בקלות מטופל, הפיכת בדיקות הפגיעה גנים כמה ספציפית את הרגישות של chondrocytes בחיי עיר לפגיעה מכנית.
המטרה הכוללת של השיטה הציג כתב יד זה לכמת, באופן חזותי ב- real-זמן-המרחבי היקף באתרו בתוך תא מוות/פציעה עקב המון מכני שהוחלו על העכבר שלם מלא סחוס-על-עצם explants חוץ גופית בתוך. שיטה זו דורשת ניתוח זהיר של המפרקים synovial העכבר מבלי להתפשר על הכדאיות chondrocyte, ואחריו בדיקות מכניות של ויטראז’ים חיוני explants שימוש בהתקן רכוב מיקרוסקופ הדומה פלטפורמה בדיקות שפיתחנו לאחרונה כדי לכמת תכונות מכניות הסחוס מאתר16. במהלך בדיקות מכניות, חלק גדול של המשטח מפרקיות (שלם) של העצם והטרף הוא גלוי על מיקרוסקופ פלורסצנטיות יחיד, המאפשרים ניתוח מהירה של התא הכדאיות אחרי עומס מוחל. ניתוח דומה של תא שטח הכדאיות של הסחוס מאתר explants בוצעה בעבר, אך ללא יישום סימולטני של עומס17. יישומים אפשריים של השיטה שלנו כוללים מחקרים השוואתיים כדי לחקור את הפגיעות של chondrocytes במפרק כדי תנאים סביבתיים וגורמים מכאניים מבוקרים שונים, כמו גם הקרנת טיפולים שמטרתם להפחית את הרגישות של chondrocytes כדי העמסה מכנית.
השיטות המתוארות לעיל הועסקו בהצלחה להמחיש ובר קיימא נפגע/מת ב באתרו chondrocytes במפרק של המפרקים העכבר לאחר שנקבעו עומסים מכאניים או השפעות. בפרט, הצלחנו לנתח את הפגיעות מכני של chondrocytes בתוך הסחוס במפרק שלם מלא של שני המפרקים synovial שונים: מפרק הברך (דיסטלי עצמות הירך) ואת הכתף (humeri). התוצאות נ?…
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצה להודות ד ר ריצ’רד וו ו לואיס Delgadillo לשימוש נדיב של שלהם ph ו- osmometer. בנוסף, המחברים רוצה להודות לי. אנדריאה לתרום לפיתוח הראשוני של מערכת בדיקות מכניות. מחקר זה מומן על ידי NIH P30 AR069655.
Calcein, AM | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C3100MP | 20x50mg , Eugene, OR, USA |
Propidium Iodide | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | P3566 | 1 mg/mL solution in water, 10mL, Eugene, OR, USA |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | 1L DMSO, anhydrous, ≥99.9%, St. Louis, MO, USA |
HBSS (calcium, magnesium, no phenol red) | Gibco by Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | 1X, 500mL, Grand Island, NY, USA |
Feather surgical blade (#11) | VWR | 102097-822 | Hatfield, PA, USA |
Vapor pressure osmometer, VAPRO | ELITechGroup | Model 5520 | Puteaux, France |
pH meter | Beckman | Model Phi 32 | Brea, CA, USA |
Eppendorf thermomixer | Eppendorf AG | Model 5350 | Hamburg, Germany |
Motorized inverted research microscope | Olypmus | Model IX-81 | Center Valley, PA, USA |
Wooden applicator | Puritan Medical Products Company, LLC | 807 | 6"x100, Guilford, ME, USA |
1.5 Glass coverslips | Warner Instruments, LLC | 64-1696 | #1.5, 0.17mm thick, 40mm diameter, Hamden, CT, USA |